重组幽门螺杆菌口服脂质体疫苗的制备及其免疫保护作用的基础研究

发布时间：2020-05-05 21:08

【摘要】： 背景/目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因；与胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(MALT)的发生亦密切相关，世界卫生组织属下的癌症研究委员会1994年已将其列为Ⅰ类致癌原。临床现有的根除Hp的手段主要是联合应用抗生素，但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等，限制了抗菌药物的疗效，进行免疫防治研究十分迫切。鉴于目前Hp疫苗研制中须使用黏膜免疫佐剂霍乱毒素(CT)或不耐热肠毒素(LT)，限制了疫苗在人体中的应用。因此本研究的目的是：选择Hp尿素酶B亚单位(UreB)和过氧化氢酶(Kat)为靶抗原，应用基因工程技术分别构建重组UreB(rUreB)和重组Kat(rKat)原核表达体系，表达产物经快速蛋白质液相色谱系统(FPLC)纯化后，逆向蒸发法制备重组蛋白的脂质体疫苗，并在BALB/c小鼠模型中评价其对Hp感染的免疫保护作用，并对其免疫保护机制进行探讨。方法 1．运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出UreB结构基因，装入pT(pGEM-T-easy vector)载体进行序列分析，将UreB基因亚克隆入表达载体pET-22b(+)并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，采用FPLC系统经Sephacyl S-200凝胶过滤和Sepharose Fast Flow阴离子交换两步层析获得纯化rUreB，免疫印迹法检测抗原性。15L发酵罐发酵制备mg级以上的重组蛋白。 2．运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出Kat结构基因，装入pET-22b(+)载体进行序列分析，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，贝尔斯-西策尔斯Beers Sizers)法测定重组过氧化氢酶活性，表达Kat的包涵体经分离、洗涤、溶解、复性，采用FPLC系统经Sepharose Fast Flow阴离子交换、Octyl-Sepharose-4FF疏水层析、Sephacyl S-200凝胶过滤 2003级博士研究生论文层析获得纯化的rKat，。 3.用逆向蒸发法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的重组蛋白和有/无免疫佐剂的口服疫苗，并用透射电镜测定其粒径。BALB/c小鼠分为6组，分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、UreB重组蛋白+CT、脂质体包裹UreB重组蛋白、脂质体包裹UreB重组蛋白和CT、脂质体包裹(ureB十Kat+cT)，每周1次共4次，末次攻击2周再用活HP攻击3 次，5周后处死小鼠，行胃组织快速尿素酶试验、你的定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分。RT一PCR检测小鼠脾淋巴细胞中丫一干扰素(工NF一丫)和白细胞介素一4(工L一4)表达。结果 1.成功构建了ureB重组质粒pT一ureB，序列分析显示UreB结构基因由17lobp组成，开放读框完整无中断，与GeneBank中ureB编码序列(M60398，HP ureB)进行比较，其同源性为97.0%(1658/1710)， pET一22b(+)心reB经 Notl和xhol双酶切后显示，重组质粒载体构建成功。SDS一PAGE显示表达产物相对分子量约为64kD，可溶性表达蛋白占全菌蛋白的18%以上，纯化后获得纯度达95%的重组蛋白，免疫印迹显示该蛋白可被抗尿素酶B亚单位单抗所识别。 2.成功构建了Kat重组质粒pET一22b(+)/Kat，序列分析显示kat结构基因由1512bp组成，开放读框完整无中断，与GencBank公布的Hp 过氧化氢酶编码序列一致，SDS一PAGE显示表达产物相对分子量约为 58kD，以包涵体为主的重组过氧化氢酶蛋白占菌体总蛋白的24.4%，纯化后获得纯度达96%的重组蛋白，并显示有良好过氧化氢酶活性。 3，成功制备了不同组分的脂质体疫苗，电镜下负染显示粒径为0.7 士0.2“m。PBS组、空白脂质体组、rUreB+CT组、脂质体包裹rUreB组、脂质体包裹rureB+eT组、脂质体包裹(rureB+水at+eT)组的免疫保护率分别为0(o/11)、o(0/一1)、55.3%(7/12)、54.5%(621一)、63.6%(7八1)、 83.3%(10/12)，ureB重组蛋白+cT组免疫保护率与脂质体包裹UreB重组蛋白组比较无显著性差异印。.05)，脂质体包裹ureB重组蛋白十cT组免疫保护率与脂质体包裹(rureB十rKat十cT)组比较有显著性差异 (P0.05)。各疫苗组HP定植评分均明显低于PBs和脂质体对照组南方医院全军消化病研究所 2003级博士研究生论文 (P0.ol)，且UreB+Kat双价疫苗组较三个单价疫苗组比较也有显著性差异护0.05)。疫苗组不仅能降低HP的定植，而且能减轻你造成的小鼠胃勃膜的局部慢性炎症反应(PO.05)，但各疫苗组间比较未见显著性差异(外0.05)。HP攻击后，与对照组比较，各疫苗组脾淋巴细胞州F一Y mRNA水平较低(只0.05)，而工L一4mRNA水平则较高(只0.05)，各疫苗组间比较未见显著性差异(P0.05)。结论 1.应用基因重组技术构建分别pET一22b(+)心reB和pET一22b(+)服at 重组质粒，并在大肠杆菌中表达，表达产物经快速蛋白质液相色谱系统 (FPLC)纯化后，获得了纯化的重组蛋白，为HP疫苗的研制提供了物质基础; 2.首次用逆向蒸发法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的重组蛋白口服疫苗，并在BALB/c小鼠HP感染模型中证实了脂质体能代替霍乱毒素的勃膜免疫佐剂作用; 3.动物实验证明HP疫苗能降低HP在小鼠胃内的定植密度，同时能减轻胃勃膜炎症反应程度，双价疫苗较单价疫苗免疫保护作用更
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重组蛋白,消化病,尿素酶,自动扫描

6.BL21印ET一UreB)after3hinduetionwith0.smMIPTG;7.BL21印ET一UreB)after3hinduetionwith0.smMIPTG;图1一10重组蛋白含量扫描分析Fig.1一10Seananalysisoftheeontentofreeombinantprotein凝胶自动扫描分析，其重组尿素酶蛋白占菌体总蛋白的18.3%。南方医院全军消化病研究所

免疫印迹分析,重组蛋白

纯化的重组蛋白进行免疫印迹检测，经DAB显色，结果显示在64kD处，纯化重组蛋白出现阳性条带，，而BL21印ET一22b(+)/UreB)无IPTG诱导3h菌体为弱阳性反应染色，而BLZI菌体无染色，见图1一16，提示重组蛋白可被特异性抗尿素酶B亚单位单抗所识别。鑫{群撇撇潺琳卿绷64kD图1一16重组ureB的免疫印迹分析Figl·16WesternbfotanalysisofU代Breeo班binan印rotein1.SonieatesuPernatantofBLZIafter3h2.SonieatesuPernatantofBL21(PET闷UreB)after3hwi比outIPTG;3·PurinedrUreB南方医院全军消化病研究所
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R57

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