脂肪酸转位酶CD36的表达与棕榈酰化修饰在高脂诱导的肝细胞凋亡中的作用

发布时间：2020-05-06 12:26

【摘要】：背景与目的:随着生活方式及饮食结构的改变,非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)作为代谢综合征组成部分,现已成为影响世界人口达三分之一的最常见的肝脏疾病。NAFLD是由包括单纯性肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化和肝癌等一系列疾病组成[1]。研究表明,非酒精性肝炎(NASH)作为NAFLD重要进展性病变,是导致肝硬化和肝癌的重要病因之一[2]。因此,早期预防及治疗NASH对于预防肝硬化和肝癌显得尤为重要,但是目前尚无对NASH着实有效的防治方法。高脂血症是NASH的重要致病因素之一,既往研究显示,NASH病人血清中含有高浓度的游离脂肪酸,其与疾病的严重程度及进展高度相关[3]。另有研究表明,在NASH病人及小鼠NASH模型中可见到较为明显的肝细胞凋亡,其作为NASH的一个重要的形态学和病理学标志,与肝损伤的严重程度密切相关[4,5]。因此,研究高脂诱导的肝细胞凋亡可能是解决或治疗NASH的一个潜在靶点。脂肪酸转运酶(Fatty acid translocase,FAT/CD36)广泛分布于单核巨噬细胞,脂肪细胞等多种细胞表面,属于清道夫受体B家族,可以与多种配体结合,如长链脂肪酸(LCFA)和氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)等。在人的正常肝脏中CD36含量较低,但在NAFLD患者的肝脏组织中CD36表达显著增加[6,7]。前期研究发现,肝脏LCFA的摄取及脂质积聚与CD36有直接关系[8]。但目前尚不明确CD36是否参与了NAFLD病变中的肝细胞凋亡。因此,本文拟通过体内外模型探讨CD36的表达及棕榈酰化修饰在肝细胞凋亡的作用,并初步探讨其相关分子机制。方法:第一部分:体内实验,以C57BL/6J小鼠为实验动物,将其随机分两组,分别给予正常饮食(NCD)和高脂饮食(HFD)22周,建立小鼠NASH模型。体外实验,将HepG2细胞分为两组,不给予PA组(含0.2%BSA的DMEM培养基)和给予PA组(含0.2%BSA的DMEM培养基+PA),以上共处理24h。收集小鼠血清,ELISA法检测肝损伤转氨酶活性;HE染色观察肝脏脂肪变性及炎症水平;用Western Blot法检测小鼠肝脏组织及HepG2细胞中CD36及相关凋亡蛋白(bcl-2 and bax等)等的表达水平;用TUNEL染色、caspase-3活性试剂盒、Annexin-V/PI流式细胞术检测肝脏组织和细胞的凋亡情况。第二部分:体内实验,对C57BL/6J小鼠随机分组,通过尾静脉注射2种慢病毒,第一组是对照组NC病毒(NC),第二组是野生型CD36过表达病毒(CD36OE),给予两组小鼠HFD喂养8周,构建超表达CD36的小鼠模型。在HepG2细胞上,用表达NC和野生型CD36(CD36OE)的慢病毒感染细胞,建立超表达HepG2稳定细胞系。另用小干扰RNA(siRNA)转染HepG2,构建低表达CD36的HepG2细胞。用Q-PCR鉴定CD36的干扰效果,运用Annexin-V/PI流式细胞术检测干扰后HepG2细胞凋亡情况。第三部分:体外实验,慢病毒构建CD36棕榈酰化位点突变(AA-SS)的HepG2细胞系。ABE法鉴定CD36棕榈酰化程度;用Western Blot法检测bcl-2、p-bcl2等的凋亡通路蛋白的表达水平;用caspase-3活性试剂盒检测相应活性;用染色质免疫共沉淀实验检测bcl-2组蛋白乙酰化水平。结果:第一部分:小鼠肝脏石蜡切片进行HE染色,结果发现与NCD相比,HFD组:肝细胞脂肪变性及大量炎性细胞浸润;血清肝功能转氨酶增强,提示有肝脏损伤;提取肝脏组织蛋白,Western Blot显示CD36表达增加;TUNEL阳性细胞增多;caspase-3活性增加,bax表达增加(P0.05)。体外实验棕榈酸处理HepG2细胞,流式凋亡细胞增加,caspase-3活性增加,TUNEL染色增加,bax表达增加,bax在线粒体表达增加,bcl-2表达减少,bcl-2磷酸化水平降低。以上结果提示高脂促进肝脏细胞凋亡增加,CD36表达增加。第二部分:野生型CD36过表达的小鼠及HepG2细胞,Western Blot检测小鼠肝脏组织和细胞中的CD36表达明显增加,提示模型构建成功。与NC组相比,CD36过表达促进小鼠肝脏TUNEL阳性细胞增加,流式凋亡细胞增加,caspase-3活性增加。(P0.05)。进一步,给予HepG2细胞CD36干扰后,流式检测凋亡细胞明显降低(P0.05)。从而提示肝细胞CD36表达增加与肝细胞凋亡密切相关。第三部分:细胞实验结果显示,PA处理可以促进HepG2细胞的CD36棕榈酰化修饰;CD36棕榈酰化修饰可以明显促进HepG2细胞的凋亡水平,同时抑制bcl-2蛋白的表达及磷酸化水平,促进bax在线粒体中表达增加。染色质免疫共沉淀结果表明,抑制棕榈酰化修饰可以明显促进bcl-2启动子乙酰化反应,从而促进bcl-2转录,使得凋亡减少。结论:1.高脂饮食可以促进NASH的发生,促进CD36表达,小鼠肝细胞凋亡增加;2过表达CD36后,肝细胞凋亡增加;而干扰CD36后肝细胞凋亡降低。3.棕榈酸可以促进CD36的棕榈酰化修饰;而抑制CD36棕榈酰化可以通过促进bcl2的磷酸化及启动子乙酰化反应,促进bcl-2转录,从而降低肝细胞凋亡的发生。
【图文】：

计学方法究数据采用 SPSS22.0 统计软件进行统计分析，实验数据用均mean±SD）表示，两处理组间采用独立样本均数 t 检验，以 P有统计学意义。饮食对小鼠肝脏功能的影响H 模型制作成功，收集给予普通饮食（NCD）和高脂饮食（鼠肝脏组织及血清，HE 染色如图 1A，相比于 NCD 组，高脂肝脏空泡样变性及炎症细胞浸润。同时血清肝功能转氨酶指标P<0.05,图 1B）。提取肝脏组织的 mRNA，检测炎症指标 TN饮食明显促进了 TNF-α 的表达（P<0.05，图 1C）。

TUNEL 染色检测显示 HFD 小鼠阳性细胞明显增加（图2A），小鼠肝脏组织的 Caspase-3 的活性水平明显增加（图 2A），Q-PCR 结果提示促凋亡基因 bax 的表达增加，差异有统计学均有统计学意义，以上结果均说明高脂饮食可以促进小鼠肝脏细胞凋亡的发生。图 2 高脂喂养对 C57BL/6J 小鼠肝脏凋亡影响Figure2 The effect of high fatty diet on mice liver.A.小鼠肝脏 TUNEL 染色 B.小鼠肝脏 caspase-3 活性检测 C. 小鼠肝脏bax mRNA 水平检测。数据以均数±标准差表示（n≥6）*P<0.05 与 NCD 组比较。A．TUNEL staining on mice liver B. caspase-3 activity of mice liver C. thebax mRNA of mice liver. Results are expressed as mean ±SD（n≥6），，*P<0.05
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575

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本文编号：2651250