基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响

发布时间：2020-05-06 13:14

【摘要】：肝纤维化是多种病因引起的慢性肝损伤所致的病理改变,表现为肝内的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分过度沉积,基质硬度增加,并影响肝脏功能,是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。研究发现,肝细胞在肝纤维化进程中扮演重要角色,其凋亡、异常迁移和力学信号转导可启动、参与肝纤维化进程。然而,目前对于基质硬度变化与肝细胞功能的关系尚不明确,相关机制也不甚清楚。因此,本课题以肝细胞为研究对象,基质硬度为研究条件,在二维/三维(2D/3D)尺度下探索不同基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响及其机制,主要研究内容和结果如下:(1)不同基质硬度作用下肝细胞的转录组测序(RNA-Seq)及生物信息学分析采用化学交联法制备了硬度可调节的2D聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)水凝胶基质,用于构建体外细胞培养模型,实验所用软(Soft)、中(Moderate)、硬(Stiff)三种基质硬度分别模拟正常肝组织、肝纤维化早期和晚期肝组织硬度。实验结果显示不同硬度PVA基质表面生长的肝细胞,状态良好,凋亡率低,同时可获得高质量的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)并用于RNA-Seq检测及生物信息学分析。对测序获得的差异表达基因进行基因分类和信号通路富集分析,结果显示不同基质硬度影响肝细胞生长、细胞凋亡坏死、细胞肌动蛋白骨架重排、细胞间连接、细胞-基质互作、上皮-间质表型转换等生物功能和信号通路;通过实时定量PCR(qRT-PCR)对相关差异表达基因进行验证,基因定量结果与测序结果基本一致,提示RNA-Seq结果准确度较高,具有参考意义;参考生物信息学分析的结果,下一步从实验水平考察不同2D基质硬度对肝细胞功能的调控及机制。(2)不同2D基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响及机制借助于(1)中构建的硬度可调节的体外细胞培养平台,探究2D不同基质硬度对肝细胞形貌、凋亡坏死、迁移性能和力学特性的影响及机制。结果显示,Stiff组可促进肝细胞骨架重排、伪足产生及细胞极化;显著性上调骨架相关蛋白F-actin和α-tubulin的表达,显著性下调肝细胞功能标志蛋白Albumin的表达;Stiff组可诱导β-连环蛋白(β-catenin)入核,进而显著上调肝细胞的死细胞比例,提示肝纤维晚期的病理硬度,可损害肝细胞功能、诱导肝细胞凋亡。基质硬度与裱衬蛋白浓度对单个肝细胞的迁移能力具有两相调节作用,实验浓度范围内,裱衬有0.01mg/m L纤连蛋白(fibronection,FN)的Soft组上生长的单个肝细胞具有最大的迁移轨迹、位移和速度;对融合肝细胞而言,细胞的迁移性能受基质硬度和时间共同调节,短时间内(6 h),Soft组融合肝细胞迁移能力显著增强,长时间段内(48 h和72 h),Stiff组迁移能力显著上调。基质硬度调控单个和融合生长肝细胞的杨氏模量和单个生长细胞的应力分布,原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)检测的融合生长肝细胞的杨氏模量高于单个生长肝细胞,Moderate组肝细胞具有最大杨氏模量;对Soft和Moderate组进行有限元三维细胞模型分析的结果显示,在相同均布力作用下,Soft和Moderate组细胞应力分布相似,边缘位置具有较大应力分布,且Soft组最大Mises应力显著高于Moderate组。体内外水平研究表明,不同基质硬度可通过β-catenin介导的细胞-细胞间连接和整合素-β1(Integrin-β1)介导的细胞-基质间连接两大系统的平衡互作,实现对细胞杨氏模量的调节,Moderate组细胞杨氏模量最大,认为Moderate组基质的硬度,较Soft和Stiff组而言,更为接近两大黏附系统平衡的临界值,在临界值硬度的基质上,细胞具有最大杨氏模量。(3)不同3D基质硬度对肝细胞生物学功能的影响在(2)的研究基础上,进一步探究3D基质硬度对肝细胞生物学功能的影响,三种硬度分别与(2)中硬度相对应;结果表明,3D-Stiff组显著性上调肝细胞的死细胞比例;3D不同基质硬度对肝细胞的迁移无显著影响。与2D中的结果类似,3D-Stiff组可诱导β-catenin蛋白进入细胞核内,调控下游基因表达。本部分结果提示,3D-Stiff基质模拟的肝纤维化晚期病理硬度可通过诱导肝细胞的凋亡加剧肝纤维化疾病进程;同时,3D-Stiff可诱导激活β-catenin的入核信号通路,为后续研究3D基质硬度调节肝细胞凋亡坏死、迁移行为和力学特性变化的深入机制指明方向。综上所述,本文成功构建了模拟正常肝组织、肝纤维化早期和晚期肝组织硬度的体外细胞培养模型;发现了2D/3D Stiff基质可能通过调控肝细胞骨架重排、极化、下调肝细胞功能标志蛋白表达、上调肝细胞凋亡和迁移,参与肝纤维化疾病进程,并初步证实Integrin-β1和β-catenin所介导的细胞-基质间连接和细胞-细胞间连接的平衡互作,参与了不同基质硬度对肝细胞力学特性变化的调节。本文的研究结果有助于深入认识基质硬度通过肝细胞功能调节,影响肝纤维化疾病进程的重要地位;同时从力学生物学的角度为临床肝纤维化的治疗提供新的研究视角和思路。
【图文】：

肝星状细胞,肝窦内皮细胞,微绒毛,肝细胞

图 1.1 肝纤维化发病机制。在正常肝脏内，肝脏具有微绒毛，肝星状细胞储存视黄醇。肝窦内皮细胞上有窗孔。在各种病因的肝损伤进程中，肝细胞丧失微绒毛并发生凋亡，由于肝窦内皮细胞的缺乏，使得炎性细胞浸润于肝细胞。此外，kuffer 细胞被激活，诱发了肝星状细胞的激活，导致大量 ECM 蛋白，包括原纤维胶原蛋白等，沉积在肝窦间隙内[14]。Figure 1.1 Pathogenesis of liver fibrosis. In healthy liver, hepatocytes are studded with microvilli,HSCs store retinol and sinusoidal endothelial cells display fenestrae. During liver injury by a varietyof causes, hepatocytes lose microvilli and may undergo apoptosis. The sinusoidal endothelial cellsbecome devoid of fenestrae allowing inflammatory lymphocytes to infiltrate in the hepaticparenchyma. Furthermore Kupffer cells are activated, which in turn trigger HSC activation. As aresult, large amounts of ECM proteins, including fibrillar collagens, are deposited in the Space ofDisse[14].临床上应用最为普及的肝脏组织力学特性检测手段，为超声波瞬时弹性成像（transient elastography，TE）技术[19]。TE 技术的基本原理是（图 1.2）: 在能够产生和接收超声波的换能器上装有振荡探头，探头可产生一个小振幅的低频振荡

原理图,瞬时弹性,成像技术,超声波

2（A）基于超声波瞬时弹性成像技术检测肝硬度的原理。（B）正常肝脏无脂肪肝化（C）正常肝脏无脂肪肝有纤维化的 FibroScan 的图像[19, 21]。ure1.2 (A) Principe of transient elastography used in liver stiffness measurement. Fibroes: (B) normal hepatic parenchyma without steatosis (C) hepatic parenchyma without stwith fibrosis[19, 21].由于肝组织内 ECM 的含量与其表观的弹性系数存在相关性，该技术主要测肝纤维化和肝硬化，并能作为肝纤维化的分期指标。临床检测发现，值范围在 2.4 到 75.4kPa 之间[22, 23]。通过 TE 测定的肝硬度的正常值一般1.6 kPa，和年龄无关，但男性略高于女性（5.8 1.5 vs.5.2 1.6 kPa，p = 0文献报道，一般E 7.0 kPa 为F0-F1期，7.0 kPa~9.5 kPa为F2期，，9.5 kPa为 F3 期， 12.5 kPa 为 F4 期，不同的疾病在分期上有一定的不同，oScan 提供的参考分期标准，TE 所测得的肝组织杨氏模量值和纤维化分在如图 1.3 所示的联系。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.2

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