LSDP5在肝脏脂肪和脂滴代谢中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-06 13:24

【摘要】：研究背景：脂肪肝（liver steatosis or fatty liver）是各种病因造成脂肪代谢异常时最为常见的一种肝脏疾病，在我国约20%~30%的人患有脂肪肝。脂肪肝的典型病理变化是肝细胞内过多中性脂肪（neutral lipid）储积，并出现脂滴（lipiddroplet，LD）。目前对脂肪肝的病因研究较多，但对肝细胞内脂滴代谢和形成的研究较少。脂滴（LD）早期被认为仅仅是一个类似于糖原的能量储存结构，但是目前研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂的、活动旺盛、动态变化的多功能细胞成分。脂滴可能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解，以及信号传导过程中均起着重要的作用。脂滴表面镶嵌着多种脂滴蛋白（lipid droplet proteins，LDP），其对脂滴的稳定性和代谢过程均具有非常重要的作用。目前，在所有脂滴蛋白中，PAT家族成员是最为重要，也是研究最多的一组分子。PAT家族主要包括perilipin、adipophilin、TIP47（tail-interacting protein of47kDa）、S3-12以及LSDP5（lipid storage droplet protein5）。其中LSDP5是PAT家族第五个成员，主要分布于脂肪分解代谢速度较快的组织中，如肝脏、心肌、骨骼肌等，因此又称为OXPAT（oxidative tissue-enriched PAT protein）/PAT-1或MLDP（myocardial lipid droplet protein），但是其具体作用及机制目前尚不明确。研究目的：本研究拟确定LSDP5的亚细胞定位；通过构建LSDP5的截短体，分析LSDP5各个结构域的功能；确定LSDP5对肝细胞脂滴数量和大小、甘油三酯的合成和分解的影响，明确LSDP5对肝细胞脂肪代谢的作用；确定LSDP5的相互作用分子，分析LSDP5对脂滴代谢相关分子表达的影响，阐明LSDP5对肝脂肪代谢影响可能的分子机制。研究方法： 1、利用免疫荧光的方法明确LSDP5在肝细胞内的分布与亚细胞定位； 2、在肝细胞系和原代肝细胞中改变LSDP5的表达，观察其对肝细胞脂滴形态和脂代谢的影响。 3、以LSDP5为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统来筛选与之相互作用分子。并进一步通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位验证其相互作用，以相互作用的分子为线索，最终阐明LSDP5的分子功能。研究结果： 1、LSDP5是一个脂滴表面蛋白（LDP）。使用免疫荧光技术，我们发现LSDP5定位在脂滴表面。构建LSDP5截短体，，进一步研究发现LSDP5的N端，含有PAT家族保守性的PAT-1区和11-mer α-螺旋的重复序列，是LSDP5脂滴定位的关键部位。同时，细胞内甘油三酯含量测定结果提示，LSDP5的N端也是影响脂滴储积的关键区域。 2、LSDP5增加肝细胞内中性脂肪的储积。在肝细胞内过表达LSDP5，利用Nile Red荧光染料显示肝细胞内脂滴的形态和数量。结果表明LSDP5能够明显增加肝细胞内大脂滴的比例，提高细胞内甘油三酯的含量。LSDP5的沉默使细胞内的脂滴增大受到明显的抑制，胞浆内脂滴明显变小，肝细胞中甘油三酯含量也明显降低。 3、 LSDP5可以影响脂肪分解和脂肪酸的氧化，并与具有脂肪分解作用的蛋白ES1（esterase1）存在相互作用。 LSDP5的沉默刺激脂肪分解，上调甘油三酯分解速率和脂肪分解相关酶的转录，增加脂肪酸β氧化速率和线粒体的数目。通过酵母双杂交，我们筛选出了与LSDP5相互作用的分子ES1。ES1是一个在肝脏高表达的65KD的糖蛋白，它能够水解许多的酯类，包括甘油三酯和其他的脂肪酸酯。进一步应用免疫共沉淀和免疫荧光共定位，我们证明LSDP5能够与ES1相互作用。结论：本研究证实LSDP5是一个定位于脂滴表面的蛋白质，可以促进肝细胞内脂滴的增大和甘油三酯的储积。其机制可能是通过LSDP5与ES1的相互作用，抑制ES1对于甘油三酯的水解，并进一步减少脂肪酸的β氧化来实现的。抑制LSDP5的表达，可以有效减少肝细胞内甘油三酯的储积，因此LSDP5有望成为治疗脂肪肝的新靶点。
【图文】：

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图 1 脂滴的结构（摘自参考文献[7]）前我们还不清楚脂滴蛋白是如何定位在脂滴上的，这种定位是节。从概念上来说，含有亲水的穿膜延伸结构的蛋白质是不能单层膜表面的。定位在脂滴上的蛋白至少要满足下述两种结构一，这种蛋白质一定要有长的膜嵌入的结构域，在磷脂单层的单层膜。典型的例子是微囊素（caveolins），它含有定位在质膜结构[17]；二酰甘油酰基转移酶 2（DGAT2）也属于此类[18]。第可以通过双亲性的螺旋结构，作为一个膜蛋白结合到脂滴表面族蛋白（perilipin、adipophilin、S3-12、TIP47）[15]。然而最新许多脂滴蛋白，如甲基转移酶 AAM-B（methyltransferases AAltransferase-like protein 7A）、ALD1 (associated with lipid droplet p似的 N 端疏水区。然而这些疏水结构是否是这些脂滴蛋白定位机制还有待进一步研究证实[19]。更有趣的是，研究发现，包

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第四军医大学博士学位论文1.2 脂滴的形成脂滴的生命周期开始于脂肪酸（fatty acid，FA）。细胞外白蛋白（albumin）和载脂蛋白（apolipoprotein）将脂肪酸带到细胞表面。载脂蛋白中，脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）作用于甘油三酯（triglycerides，TG），使甘油三酯上的游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）释放出来。游离脂肪酸借助脂肪酸转运蛋白（fatty-acid transport proteins）或是脂肪酸异位酶（fatty-acidtranslocase）通过被动扩散的方式进入细胞内[21]。同时，在许多类型的细胞内，如肝脏，细胞可以利用糖类，通过从头合成的方式生成脂肪酸（图 2）。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.5

【共引文献】