自噬对炎症性肠病肠上皮细胞趋化因子表达的调控及机制研究

发布时间：2020-05-07 01:40

【摘要】：目的探究炎症状态下自噬相关蛋白p62和ATG16L1对肠上皮细胞(IECs)趋化因子表达的调控及其机制。方法培养Caco-2细胞建立肠上皮细胞模型。使用白介素-1β(IL-1β)建立炎症性肠病(IBD)体外模型。运用Western blot技术检测p62、p65、ATG16L1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、核因子-κB(NF-κB)以及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的表达;运用Real-time PCR技术检测p62、白介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA水平;运用ELISA技术检测IL-8和MCP-1的分泌;使用小干扰RNA(siRNA)下调p62、p65和ATG16L1的表达。结果1.IL-1β调控肠上皮细胞p62表达的机制研究IL-1β刺激细胞后,p62蛋白表达增加,而自噬标志蛋白LC3B-II无明显改变,提示p62的增加与自噬过程受抑制无关。IL-1β促进p62 mRNA表达上调,提示p62的增加与激活转录有关。使用蛋白合成抑制剂cycloheximide处理细胞后,IL-1β诱导的p62表达被抑制,而使用自噬抑制剂bafilomycin A1处理细胞后,IL-1β诱导的p62表达明显升高,表明IL-1β是通过促进转录和蛋白合成引起p62上调。使用siRNA下调p65抑制NF-κB的激活,IL-1β诱导的p62表达下降,表明NF-κB调控p62表达。2.p62调控肠上皮细胞趋化因子表达的机制研究IL-1β刺激细胞后,NF-κB与MAPK通路均激活,而p62表达的升高伴随NF-κB的激活,提示p62可能参与调控NF-κB的激活。使用siRNA下调p62,NF-κB的激活受到抑制,证明p62调控NF-κB的激活。使用siRNA下调p65抑制NF-κB激活,IL-1β诱导的IL-8和MCP-1表达均下降,表明IL-8和MCP-1的表达受NF-κB调节。使用siRNA下调p62,IL-1β诱导的IL-8和MCP-1表达也出现了下降。加入自噬抑制剂bafilomycin A1上调p62,IL-1β诱导的IL-8和MCP-1表达均明显增加,以上结果表明p62促进IL-1β诱导的趋化因子IL-8和MCP-1表达,该过程通过NF-κB介导。3.ATG16L1调控肠上皮细胞趋化因子表达使用siRNA下调ATG16L1,IL-1β诱导的IL-8和MCP-1表达均增加,表明ATG16L1负性调控IL-1β诱导的IL-8和MCP-1表达。结论在炎症性肠病细胞模型中,IL-1β通过激活NF-κB促进p62表达,而p62通过增强NF-κB激活促进IL-1β诱导的趋化因子表达。ATG16L1负性调控IL-1β诱导的趋化因子表达,其机制有待进一步研究。
【图文】：

图 1-1 IL-1β 促进 p62 表达A. IL-1β（1ng/ml 和 10ng/ml）分别处理细胞，不同时间点 p62 蛋白的表达；B．IL-1β（10ng/ml）刺激细胞，不同时间点 LC3B 蛋白的表达；C．IL-1β（10ng/ml）刺激细胞，不同时间点 p62 mRNA 的表达；（A-C）** P < 0.01，*** P < 0.001，ns 表示统计学无差异，，均与对照组相比。D．使用蛋白合成抑制剂 cycloheximide（10μM）处理细胞，加入 IL-1β 后不同时间点 p62 蛋白的表达；E．自噬抑制剂 bafilomycin A1（100nM）处理细胞，加入 IL-1β 后不同时间点 p62 蛋白的表达；（D-E）*** P< 0.001

在先前的研究中，我们证明了在肠上皮细胞中 IL-1β 通过增加转录和蛋白合成引起 p62蛋白上调，但是 p62 蛋白的上调受何种因子调控还不清楚。我们从经典的转录因子 NF-κB入手，探究 NF-κB 是否调控 p62 蛋白的表达。将 NF-κB 亚基 p65 的 siRNA 转染进入细胞，Western blot 显示 p65 蛋白表达下降，证明 siRNA 有效（图 1-2 A）。敲减 p65 抑制 IL-1β 诱导的 p62 mRNA 和蛋白表达上调（图 1-2 B-C），表明 p62 蛋白的表达受 NF-κB 调节。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

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本文编号：2652214