IRES特异性抑制性RNA阻断丙型肝炎病毒基因表达的研究

发布时间：2020-05-07 15:03

【摘要】： HCV感染呈全球性分布，以不发达国家感染率为高，我国约为3％，该病原常可引起持续感染，且与肝硬化及肝癌发生率明显相关，是当前严重危害人类健康的重要传染病。由于其体外培养尚未成功，至今尚无满意的感染模型，因而极大的限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。迄今为止尚无有效的治疗策略。所以，寻找新的抗病毒策略，预防和清除HCV持续感染很有必要。基因治疗作为一种新型的治疗策略对HCV感染防治具有重要的意义，近年来得到国内外学者广泛认同的策略主要包括反义核酸策略、核酶策略、细胞内干扰性多肽或蛋白策略、抑制性RNA策略等。 HCV为一单股正链RNA病毒，属于黄病毒属嗜肝病毒科。HCV基因含一长的5′UTR，内含多个起始密码子(AUGs)，具特异的二级结构，该结构同脊髓灰质炎病毒(PV)和脑心肌炎病毒(EMCV)的核糖体内部进入位点(IRES)相似。IRES作为HCV基因表达和复制的关键结构成为基因治疗的靶位点之一。IRNA为Coward和Dasgupta在研究PV时，偶然发现的一段60nt的核酸片段，对PV病毒的复制和表达具有较强的抑制作用。为此，探讨IRNA在体内外对HCV基因表达的抑制作用，对HCV感染的防治具有重要的现实意义。 本研究应用分子克隆技术，构建了将具自剪切作用的顺式核酶序列引入IRNA序列两端可保持IRNA一级和二级结构完整性的原核及真核表达体，并以此为基础对IRNA在体外无细胞翻译体系中对HCV IRES介导非帽结构依赖 第四军医大学博士学位论文 性蛋白翻译的抑制作用进行了研究。此外，应用脂质体细胞转染方法及新霉 素抗性筛选建立了表达IRNA及mIRNA的HHCC细胞，并应用相同方法建立了 含HCV IRES的HCV复制子。在此基础上探讨了 IRNA在细胞内瞬时表达及长 期表达对HCV IRES介导蛋白表达的抑制作用。最后，我们应用PV疫苗株感 染 IRNA表达细胞，并对其病毒致细胞病变效应及病毒滴度进行了滴定。此 外，我们还初步探讨了IRNA抑制HCV IRES介导蛋白翻译作用机理。 结果如下： 1．构建了ICh及W原核表达载体地读m认证论同mM及到较前撤然 PcRz－IRNA／PcRz－mIRNA，于目标序歹两端引入具自剪切作用的顺式 核酶序列。 2．将pGRz－IRNA及pGRz－mIRNA体夕转录体与含HCV IRES完整结构的 双顺反子对70C卜34和单顺反子…W讹RIUc体外转录体在免网状 红细胞无细胞翻译体系中进行体外蛋白翻译，证实IRNA／。IRNA在体 外对 HCV RES介导蛋白翻译具抑制作用。 3．PCRZIRNA与含 HCV IRES的 PCM’VNCRlll。共转染 HHCC细胞后，表现出 明显的抑制荧光素酶表达作用：pCRZIRNA转染含HCV IRES的HCV 复制于也表现出一定的细胞内抑制HCV IRES介导蛋白翻译的作用。 HCV IRES介导蛋白翻译作用在IRNA表达细胞中也受到明显抑制。 4．脊髓灰质炎病毒在IRNA表达细胞内的增殖受到明显抑制。 5．IRNA对 HCV 5’UTR与细胞性蛋白多肽的结合作用具有明显的竞争抑 制作用。
【图文】：

DLZOOODNAMarker，2peDNA3APal/凡观厅I双酶切，3peRz一IRNA助al/及翻班双酶切，4peRz一mIRNA助al/丑:又刃班双酶切，5人DNA/HJ’ndIII+Ec研I双酶切。图1一8真核质粒酶切鉴定结果28

l234l，2peRz一IRNAPCR产物，3peRz朋IRNAPCR产物，，4DL2000DNAMarker。图1一9真核质粒PCR鉴定结果……_…_{{{}}}、井叠羹羹图1一10真核质粒测序图29
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R512.6

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本文编号：2653153