TLR2在大鼠肝细胞EMT现象中的研究

发布时间：2020-05-07 20:44

【摘要】：研究背景与目的肝纤维化和它的终末阶段肝硬化在世界范围威胁着人类健康。乙型、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病及非酒精性肝病所引起的肝纤维化、肝硬化也相当常见。研究表明肝硬化是不可逆的,而肝纤维化是可逆的。因此,有效的抗纤维化治疗就成了一个非常紧迫的问题。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节,也是目前研究的热点。但是近3年的研究又认为肝细胞在肝纤维化中亦起到非常重要的作用。肝细胞约占肝脏细胞总量的80%,数量最多,功能重要。肝细胞的炎症坏死,肝细胞损伤,脂质过氧化,凋亡等均在促使肝纤维化中起到重要作用。越来越多研究表明,除HSC在肝纤维化发生学中是主要的纤维源性细胞外,肝细胞也具有潜在的纤维源性[2]。并且研究认为肝细胞主要是通过上皮-间质转化为成纤维细胞从而促使肝纤维化的形成。 TLR作为主要的模式识别受体,在机体先天性免疫应答中发挥着重要作用,并在肝脏疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纤维化等的发生、发展过程中发挥重要作用为此,本论文研究目的旨在揭示肝细胞EMT现象中是否有TLR的调节作用,以深入阐明肝纤维化的发病机制,也为肝纤维化的早期干预提供新的思路。方法一、肝细胞的分离与鉴定雄性Sprague-Darwley大鼠(150g-200g),分离门静脉并插管,依次灌注胶原酶,37℃原位消化,3次4℃水平离心得到肝细胞,于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培养,隔天更换培养液。台盼蓝染色鉴定细胞存活率。显微镜下观察死亡与正常的肝细胞,鉴定肝细胞成活率。二、TGF-β刺激肝细胞产生EMT现象当细胞生长基本贴满皿底时,以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中加入TGF-β(5 ng/mL)作用48 h后,使用倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变并拍照。以不加TGF-β组作为对照组。提取细胞总RNA,PCR检测E-cad、vimentin的mRNA表达。三、TLR2在肝细胞EMT现象中的表达普通PCR检测E-cad、vimentin的mRNA表达后,再检测TLR2 mRNA的表达。四、统计学分析数据用均数±标准误表示,数据由SPSS 13.0软件统计包处理。两组之间比较用t检验,相关性比较用线性相关,多组间的比较用One-Way ANOVA方差分析:方差齐性用LSD方法比较;方差不齐用Dunnett’s方法比较。P0.05认为有统计学差异。结果一、肝细胞鉴定台盼蓝染色鉴定肝细胞存活率95%以上,能满足实验要求。二、TGF-β刺激肝细胞产生EMT现象 (一)TGF-β刺激肝细胞对细胞形态的影响TGF-β刺激48小时的肝细胞细胞形态由平铺弥漫的岛状细胞变成纺锤形间隙较大的细胞。细胞逐渐分离。 (二)TGF-beta对肝细胞EMT现象相关指标mRNA的影响TGF-β刺激48小时的肝细胞的E-cad mRNA表达明显低于不加刺激的正常HC的表达(P0.05)。而TGF-β刺激48小时的肝细胞的vimentin mRNA表达明显高于不加刺激的正常肝细胞的表达(P0.05)。三、TLR2在肝细胞EMT现象中的表达TGF-β刺激48小时的肝细胞的TLR2 mRNA与蛋白水平的表达明显高于不加刺激的正常HC的表达(P0.05)。结论一、TGF-β刺激肝细胞可引起肝细胞形态学的变化,E-cad mRNA水平表达下降,vimentin mRNA水平表达上升。提示TGF-β可以促使肝细胞产生EMT现象。二、TGF-β刺激肝细胞产生EMT现象时TLR2从中起到一定的作用。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2

【参考文献】