RNA干扰技术阻断黏着斑激酶表达对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

发布时间：2020-05-09 06:17

【摘要】： 肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种致病因子引起慢性肝病,进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化、增殖进而合成大量的胶原等细胞外间质(extracellular matrix, ECM)成分是肝纤维化形成的中心环节。因此,抑制HSCs活化、增殖并诱导其凋亡是逆转肝纤维化的关键所在。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是整合素信号转导通路中连接整合素与下游信号分子的媒介,处于细胞内多条信号转导通路的交汇点,能激活多条信号转导通路。FAK被激活后可以调节其下游信号分子,引起细胞骨架重组和多种基因表达,如可以通过Ras依赖的丝裂源活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases, MAPK)途径引起级联反应,参与细胞铺展、增殖、分化与凋亡等多种生物学行为。多项研究表明FAK在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及多种肿瘤细胞的增殖、凋亡中发挥关键作用,但对HSCs增殖与凋亡的影响知之尚少。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们采用RNAi技术,以FAK为切入点,在前期应用含U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的质粒载体pEGFP成功构建靶向FAK的短发卡RNA(shRNA)干扰重组体的基础上,在阳离子聚合物介导下将干扰质粒瞬时转染HSCs,研究特异性阻断FAK表达对纤维连接蛋白(fibronectin, FN)刺激的HSCs增殖与凋亡的影响及其机制。目的:采用RNAi技术,探讨FAK shRNA对HSCs增殖、凋亡的影响以及FAK介导的信号转导通路、bcl-2、bax在HSCs增殖与凋亡中的作用。方法:体外培养HSCs,并以FN刺激HSCs增殖,在阳离子聚合物梭华-sofast~(TM)介导下,应用FAK shRNA质粒转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6。实验分5组:①空白对照组(简写为Con组);②FN刺激组(简写为FN组);③转染试剂组(简写为sofast组);④pEGFP-HK shRNA组(简写为HK组);⑤pEGFP-FAK shRNA组(简写为FAK shRNA组);②～⑤组中FN浓度均为10μg·mL~(-1)。采用MTT法测定HSCs增殖;流式细胞术(flow cytometry, FCM)、末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法与透射电镜技术检测HSCs的凋亡;采用Western blot及real-time Q-PCR等实验方法,检测FAK、ERK1、bcl-2、bax与caspase-3蛋白及其mRNA表达;Western blot实验方法检测转染前后p-FAK、p-ERK蛋白表达情况。结果:①FAK shRNA抑制FAK mRNA表达:real-time Q-PCR结果显示转染后FN组FAK mRNA表达较Con组升高57.00%,P0.01,但与sofast组、HK组之间无显著性差异;FAK shRNA组FAK mRNA表达水平较HK组显著下降,P0.01,且最高下调率为76.73%,出现在转染后24 h;②FAKshRNA抑制FAK表达及活化:Western blot结果显示,FN刺激后HSCs FAK的蛋白表达量较Con组升高49.70%,P0.01,但与sofast组、HK组比较无明显差异,P0.05;FAK shRNA组FAK蛋白表达量较HK组显著降低,P0.01,且最高下调率为72.53%,出现在转染后48 h。p-FAK(Tyr~(397))蛋白表达亦表现出相似的变化:FAK shRNA组p-FAK(Tyr~(397))蛋白较HK组显著下降,P0.01,且最高下调率出现在转染后48 h,与FAK蛋白的表达水平变化一致,表明FAK shRNA干预HSCs可明显抑制FAK磷酸化;③FAK shRNA抑制ERK1 mRNA表达:real-time Q-PCR结果显示,FAK shRNA组ERK1 mRNA表达较HK组显著下降,P0.01,且最高下调率为55.67%,出现在转染后48 h;④FAK shRNA抑制ERK_1表达及活化:Western blot显示FN刺激后HSCs的ERK_1蛋白表达量较Con组升高77.55%,P0.01,但与sofast组、HK组比较无明显差异;FAK shRNA组ERK_1蛋白表达量显著降低,较HK组下降了65.13%,P0.01。同时,p-ERK)1的变化也表现出相似的趋势,其最高下调率为75.47%,出现在转染后72 h;⑤FAK shRNA抑制HSCs增殖:在96孔板内转染FAK shRNA质粒,采用MTT方法检测显示,FAK shRNA组与HK组相比,对HSCs增殖有显著抑制作用,质粒转染12 h、24 h、48 h后增殖抑制率分别为11.08%、15.12%、28.62%,呈时间依赖性关系;⑥FAK shRNA促进HSCs凋亡:FAK shRNA转染HSCs 24 h后,采用FCM检测HSCs凋亡,结果显示:FN组HSCs凋亡率较Con组降低48.73%,P0.01,但与sofast组、HK组之间无明显差异;FAK shRNA组HSCs凋亡率较HK组明显增高(8.29%±0.79% vs 2.70%±0.31%),P0.01。同时采用TUNEL法显示:FN组HSCs凋亡率较Con组降低52.01%,P0.01,但与sofast组、HK组之间无明显差异;FAK shRNA组HSCs凋亡率较HK组明显增高(19.00%±0.92% vs 7.63%±0.70%),P0.01。透射电镜可观察到FAK shRNA组中大量的HSCs细胞膜皱缩,胞浆浓缩,核染色质凝集、固缩,聚集于核膜下呈境界分明的团块状、花瓣状或新月体形,有的可见核碎裂及凋亡小体形成;⑦caspase-3表达增强:real-time Q-PCR结果显示,FN组caspase-3 mRNA表达较Con组降低35.00%,P0.05,但与sofast组、HK组之间无明显差异;FAK shRNA组caspase-3 mRNA表达较HK组明显升高,P0.01,且最高上调率为60.71%,出现在转染后36 h。Western blot显示FN刺激后HSCs caspase-3蛋白表达量较Con组降低20.87%,P0.05,但与sofast组、HK组比较无明显差异;FAK shRNA组caspase-3蛋白表达量较HK组显著升高,P0.01,且最高上调率为75.29%,出现在转染后48 h;⑧bcl-2/bax比值降低:real-time Q-PCR结果显示,FN组bax mRNA表达较Con组降低33.00%,P0.01,但与sofast组、HK组之间无明显差异;FAK shRNA组bax mRNA表达较HK组明显升高,P0.01,且最高上调率为65.82%,出现在转染后36 h。Western blot显示FN刺激后HSCs的bax蛋白表达量较Con组降低19.08%,P0.01,但与sofast组、HK组比较无明显差异,FAK shRNA组bax蛋白表达量较HK组显著升高,P0.01,且最高上调率为66.06%,出现在转染后48 h。real-time Q-PCR结果显示,FN组bcl-2 mRNA表达较Con组升高35.00%,P0.01,但与sofast组、HK组之间无明显差异;FAK shRNA组bcl-2 mRNA表达较HK组明显降低,P0.01,且最高下调率为48.03%,出现在转染后36 h。Western blot显示FN刺激后HSCs bcl-2蛋白表达量较Con组升高69.53%,P0.01,但与sofast组、HK组比较无明显差异;FAK shRNA组bcl-2蛋白表达量较HK组显著降低,P0.01,且最高下调率为71.90%,出现在转染后48 h。分别把各组中bcl-2、bax翻译和转录水平的表达作一比值,可见在翻译水平和转录水平,FAK shRNA质粒转染HSCs后降低了bcl-2/bax比值。结论:在阳离子聚合物介导下瞬时转染靶向FAK的shRNA质粒,可在转录和翻译水平下调FAK表达,伴随FAK活性的下降,ERK1的表达亦表现出相似的变化,并可以呈时间依赖性地抑制FN刺激的HSCs增殖,此可能与抑制FAK-ERK信号转导通路有关;可以诱导FN刺激的HSCs发生凋亡,并在转录和翻译水平检测到caspase-3表达增强,此可能与抑制FAK-ERK信号转导通路和/或下调bcl-2/bax比值有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2

【参考文献】