Tmub1 RNAi对IL-6诱导的STAT3表达及活化的影响

发布时间：2020-05-09 07:28

【摘要】： 背景和目的: IL-6是目前公认能刺激肝细胞增殖最重要的因子,它可通过JAK/STAT3(Signal transducer and activator of transcription-3)信号通路启动或调节肝再生过程。肝脏损伤或肝叶切除肝再生过程中,IL-6表达上调,并活化STAT3,活化的STAT3即磷酸化的STAT3(pSTAT3)可以进入到核内迅速诱导即刻早期基因表达,从而调节与炎症、细胞增殖、急性期反应等有关的基因表达,以及促进肝细胞增殖和肝再生。Tmub1(transmemebrane and ubiquitin-like domain containing 1)基因是2005年由Della Fazia等通过对肝切除后肝细胞的cDNA文库与对照组肝细胞比较分析后首次报道,当时命名为hepatocyte odd protein shuttling(Hops)。其研究结果显示:肝细胞的Tmub1 mRNA在肝部分切除术(PH术)后明显增加;同时,过表达Tmub1可阻断大鼠H-35肝癌细胞增殖;而且,应用相应的逆转录病毒载体对Tmub1进行RNA干扰后引起的NIH-3T3细胞增殖也可由于Tmub1的过表达而发生增殖抑制。研究还发现,HOPS/Tmub1与eEF-1A(延长因子1-A)结合从而干扰蛋白质的合成。因此我们推测,Tmub1在肝细胞增殖和肝再生过程中担负着非常复杂而又重要的功能,在肝脏再生过程中起到传递肝细胞增殖信号或调控细胞增殖关键点的作用,但目前未见报道。如能阐明Tmub1基因转录调控机制在肝细胞增殖中的作用,对肝细胞增殖和肝再生机制的研究将是一个重要发现。 在本实验研究中,我们构建了Tmub1基因RNAi慢病毒表达载体,利用RNA干扰技术,沉默Tmub1,使大鼠肝BRL-3A细胞Tmub1基因不发挥功能,以探讨Tmub1在IL-6诱导的STAT3表达及活化中的作用,更加深入地了解Tmub1与IL-6/JAK/STAT3信号传导通路之间的关联。以求在将来能为肝功能衰竭的研究与治疗提供新的理论依据。 方法: 1.利用RNA干扰(RNAi)技术,构建Tmub1 RNAi慢病毒真核表达载体:即针对Tmub1基因设计、合成4对编码发夹RNA(shRNA)的寡核普酸序列,退火后分别将其克隆入pll3.7质粒。酶切、测序鉴定正确后,将pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和干扰质粒(Pll3.7)组成的四质粒慢病毒载体系统共转染293T细胞,对四个Tmub1干扰质粒载体进行包装,并用倒置荧光显微镜在目的细胞大鼠肝BRL-3A细胞上验证慢病毒的感染效率,Western-Blot检测慢病毒对目的细胞中Tmub1表达的干扰效果。 2.针对干扰效果最佳的干扰质粒进行包装和大量生产Tmub1 RNAi慢病毒载体LV256;随后使用Hela细胞通过流式细胞技术测定病毒滴度;最后,用G418抗生素筛选Tmub1 RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256,利用RT-PCR和Western Blot技术检测稳定感染细胞系中Tmub1的表达情况,为后续实验做准备。 3.为了研究肝细胞中IL-6与Tmub1之间的关系,将实验分为5组:Control组、Negative组、IL-6组、LV256组和IL-6+LV256组。其中,Negative组为仅感染了Pll3.7空载体质粒的大鼠BRL-3A细胞;IL-6组为根据文献报道方法用5ng/ml的重组大鼠IL-6对BRL-3A细胞进行干预;LV256组为BRL-3A/256稳定感染细胞系(Tmub1表达被有效抑制);IL-6+LV256组为使用5ng/ml重组大鼠IL-6对Tmub1 RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256进行干预。使用RT-PCR和Western Blot技术检测各组Tmub1的转录和翻译水平。 4.为了进一步探讨Tmub1 RNAi对IL-6诱导的STAT3表达及磷酸化的作用,我们同样在实验过程中采用上述分组方式,使用RT-PCR和Western Blot技术检测各组STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)表达水平的变化。以探讨Tmub1与IL-6/JAK/STAT3信号通路之间的关系。 结果: 1.将设计合成的四个shDNA模板经退火、载体线性化和连接反应,使用碱裂解法抽提质粒,并用Xba I和Nhe I分别对四个重组载体(C0019、C0020、C0021、C0022)进行双酶切鉴定和测序鉴定。结果证实,Tmub1 shRNA寡核苷酸链序列插入正确,表明Tmub1 shRNA慢病毒载体构建成功。 2.用pRSV-Rev,pMDLg-pRRE,pMD2G和干扰质粒组成的包装系统进行慢病毒载体的包装。再用包装好的Tmub1慢病毒载体感染BRL-3A细胞,培养72小时后,收取细胞,并提取细胞蛋白做Western Blot检测。结果显示C0020 Sh2-Hops-256干扰效果最佳。将含有此质粒的Tmub1 RNAi慢病毒载体命名为LV256并进行大量包装。用倍比稀释法稀释病毒液并感染Hela细胞96小时后FACS检测细胞GFP阳性率,得到滴度为2.3×108TU/ml的病毒,以不同MOI值(20、30、50、70)确定使目的细胞达到最佳转染效果时的MOI值,使用MOI=70的慢病毒感染BRL-3A后在倒置荧光显微镜下检病毒转染效率可达90%,且细胞生长状态良好。 3.在上述实验基础上使用G418筛选稳定转染细胞系BRL-3A/256。该细胞系中(LV256组)Tmub1 mRNA和蛋白表达均较Control组和Negative组显著降低(*p0.05)。Tmub1 RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256建立成功,可用于后续研究。 4. RT-PCR和Western Blot检测IL-6对Tmub1 mRNA和蛋白质表达水平。使用5ng/ml重组IL-6能够诱导体外BRL-3A细胞Tmub1表达水平显著升高(#p0.05);在BRL-3A/256细胞系中,Tmub1表达水平显著降低(*p0.05),而且IL-6刺激能够部分逆转Tmub1的RNA干扰效果,使BRL-3A/256细胞中Tmub1表达上调(#*p0.05)。 5.在Tmub1 RNA干扰对IL-6诱导STAT3表达的影响实验研究中发现, IL-6可使BRL-3A和BRL-3A/256细胞中STAT3表达水平较明显上调(#p0.05,#*p0.05);在LV256组,BRL-3A/256细胞中STAT3表达也较对照组明显增强(*p0.05)。以上结果表明,IL-6和Tmub1 RNAi均可使BRL-3A细胞STAT3表达上调,且两者的共同作用可以进一步增强细胞中STAT3的表达。同时,Tmub1可能对STAT3的表达有一定的抑制作用。 6.使用同样方法我们进一步检测了细胞中pSTAT3的表达水平。实验结果显示,在Control组、Negative组以及LV256组(均无IL-6刺激),细胞中pSTAT3的表达水平很低,而无论是给予IL-6刺激的BRL-3A细胞还是Tmub1 RNA干扰的BRL-3A/256细胞中,pSTAT3的表达均明显增强(#p0.05,#*p0.05)。更值得注意的是,在IL-6和Tmub1 RNAi的共同作用下pSTAT3表达可进一步上调(#*p0.05),而当单独给予IL-6刺激时,pSTAT3的表达水平却低于两者共同作用时的表达水平(#p0.05),说明IL-6与Tmub1之间可能存在一定的关联,Tmub1可能抑制细胞中IL-6诱导的STAT3的活化。 结论: 1.通过成功构建Tmub1的慢病毒真核表达载体,并感染大鼠BRL-3A肝细胞株,或建立Tmub1 RNAi慢病毒稳定感染细胞系,可以有效干扰肝细胞Tmub1 mRNA及蛋白质表达。 2. IL-6可诱导大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1表达上调,也可部分逆转Tmub1 RNA干扰后Tmub1的表达抑制效应。 3. IL-6可诱导大鼠肝BRL-3A细胞中STAT3表达上调,Tmub1 RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256中STAT3的表达也显著增强,而在两者的共同作用下,STAT3表达进一步增强。提示Tmub1可抑制STAT3的表达。 4.在无IL-6刺激的实验分组中,RT-PCR和Western Blot均未检测到磷酸化STAT3(pSTAT3)表达,或表达很低(LV256组),IL-6可明显增强BRL-3A和BRL-3A/256细胞中pSTAT3的表达。而当IL-6与Tmub1 RNAi共同作用时(IL-6+LV256),pSTAT3的表达又明显强于单独IL-6刺激时的表达,这就表明Tmub1可能参与了IL-6诱导的STAT3的活化过程,对STAT3的磷酸化起到一定的抑制作用。 5.由上述结论我们推断Tmub1在一定程度上抑制IL-6诱导的STAT3表达增强以及活化,从而在IL-6诱导的肝细胞增殖过程中起到重要的调控作用,防止细胞过度增殖。
【图文】：

Tmub1 RNAi 慢病毒载体感染第二天，可见病毒已成功感染大鼠肝 BRL-3A 细胞。图 1 慢病毒感染第二天荧光图片慢病毒感染第三天，，可见被感染的肝细胞较前一天明显增多。图 2 慢病毒感染第三天荧光图片

52慢病毒感染第三天，可见被感染的肝细胞较前一天明显增多。图 2 慢病毒感染第三天荧光图片G418 杀伤实验过程中所见病毒感染的阳性细胞团。图 3 G418 杀伤实验荧光图片
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575

【引证文献】

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1 刘孟刚;Tmubl在IL-6诱导的肝细胞增殖过程中的作用及其表达调控的研究[D];第三军医大学;2012年

本文编号：2655803