一氧化氮对大鼠梗阻性黄疸杆细胞凋亡的影响及其机制

发布时间：2020-05-09 15:21

【摘要】：梗阻性黄疸是临床较常见的病理状态，它的出现导致了机体各系统器官的损害以及相应的病理生理改变，其中最主要的是肝脏损伤，也是其它并发症的重要诱因。梗阻性黄疸对肝脏的损害是多方面的，随着对细胞凋亡(APO)规律的深入研究，现已发现梗阻性黄疸时的胆汁瘀积、活性氧自由基和某些细胞因子、线粒体功能障碍等均可成为引起肝细胞凋亡的因素。各种研究表明NO也参与了凋亡的生物调整，NO对细胞凋亡起着双向调控作用，在某些细胞中，NO可以促进凋亡，而在另外一些细胞中却可以抑制凋亡，目前NO对梗阻性黄疸肝细胞凋亡影响方面的研究尚未见报告。本研究利用大鼠梗阻性黄疸模型对大鼠梗阻性黄疸时血清和肝组织NO含量、肝细胞凋亡以及血清和肝组织NO含量对梗阻性黄疸大鼠肝细胞凋亡的影响进行了研究，并进一步对NO对梗阻性黄疸肝细胞凋亡影响的机制作了的探讨。材料和方法：Wistar大鼠，雄性，共54只，体重250g-300g。随机将大鼠分为（1）正常组（K组）：6只大鼠未做处理，自由进食水。（2）假手术组（S组）：18只大鼠仅做胆总管的游离，不做结扎，其他处理同梗阻性黄疸组。（3）梗阻性黄疸组（O组）：18只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，经上腹部正中切口将胆总管双重结扎，，术后自由进食水。（4）梗阻性 WP=95 黄疸+L-Arg组（A组）6大鼠只，在制备梗阻性黄疸模型的基础上腹腔注射L-Arg100mg/kg.天，共7天；（5）梗阻性黄疸+L-NAME组（N组）6只大鼠，在制备梗阻性黄疸模型基础上膜腔注射L-NAME 50mg/kg.天，共7天。其中假手术组（S组）、梗阻性黄疸组（O组）又各自分别按术后3天、5天、7天分为S3、S5、S7和O3、O5、O7小组，每小组均为6只大鼠。观察如下指标： 1、一般情况观察：包括动物精神状态、毛色、饮食状况及开腹所见。2、下腔静脉抽血采用多道全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），总胆红素（TBil）。3、采用硝酸还原酶法测定血清及肝组织NO。4、肝组织HE染色后光镜下观察肝脏的病理改变。5、原位杂交方法检测正常组、假手术组及梗阻性黄疸组肝组织中iNOS mRNA表达情况。6、采用TUNEL方法检测各组肝细胞凋亡。7、免疫组化染色观察各组肝组织中Fas、Bcl-2、Caspase-3及NF-κBP65的表达情况。结果：1、正常组和假手术组各大鼠行动敏捷，对疼痛刺激反应灵敏，皮肤、尿液颜色无改变;开腹后见:腹腔无腹水，肝脏颜色鲜红，表面有光泽，质地柔软;光镜下见：肝细胞无肿胀、坏死，肝细胞索排列整齐。而梗阻性黄疸组、A组、N组各组大鼠均有不同程度的行动迟缓、对疼痛刺激反应迟钝，皮肤、尿液呈黄色;肝脏呈程度不等的瘀胆状，表面无光泽，结扎处近肝侧胆总管呈直径约0.3cm-0.6cm不等的扩张;细胞呈不同程度肿胀、脂肪变性，肝内小胆管扩张，但未见明显肝细胞坏死，少量纤维组织增生。 2、血清和肝组织中NO含量在梗阻性黄疸组各个时相均明显高于假手术组的相应时相（P0.01），并且随着梗阻时间的延长逐渐升高；同时血清ALT、AST、TBil值和肝细胞凋亡指数亦在梗阻性黄疸组各个时相均明显高于假手术组的相应时相（P0.01），并且随着梗阻时间的延长逐渐升高； WP=96 A组给予L-Arg后血清和肝组织中NO含量上升（P0.01），而血清ALT、AST、TBil值和肝细胞凋亡指数下降（P0.01），N组给予L-NAME后血清和肝组织中NO含量下降（P0.01），而血清ALT、AST、TBil值和肝细胞凋亡指数升高（P0.01）。 3、正常组及假手术组肝组织未见Fas、Bcl-2、Caspase-3、NF-KBP65蛋白表达，梗阻性黄疸组随着梗阻时间的延长肝组织Fas、Bcl-2、Caspase-3、NF-κBP65蛋白表达量逐渐增多。A组给予L-Arg后随着血清和肝组织中NO含量上升肝组织Fas、Caspase-3蛋白表达减少（P0.01），Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达增多（P0.01）。而N组给予L-NAME后随着血清和肝组织中NO含量下降肝组织Fas、Caspase-3蛋白表达增多（P0.01），Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达减少（P0.01）。 4、原位杂交iNOS mRNA阳性细胞为胞浆内呈蓝色或紫色着染。正常组、假手术组未见阳性细胞，而梗阻性黄疸7天组肝组织出现明确的阳性杂交信号，提示梗阻性黄疸肝细胞有iNOS mRNA表达。结论：1、梗阻性黄疸时血清和肝组织中NO含量增加，并且随着梗阻病程的延长血清和肝组织中NO含量增高。其原因为梗阻性黄疸时肝组织中iNOS产生增多。 2、梗阻性黄疸时出现肝细胞凋亡，同时血清ALT、AST、TBil值增高，并且随着梗阻时间的延长肝细胞凋亡指数和血清ALT、AST、TBil值逐渐升高；而梗阻性黄疸时机体产生的NO抑制肝细胞凋亡、减少肝酶的释放，起到保护肝细胞的作用。 3、梗阻性黄疸时肝细胞凋亡过程中启动了Fas凋亡途径和Caspase-3的激活，而Bcl-2和NF-κBP65的表达亦随梗阻性黄疸时间的延长、肝细胞凋亡的增加而增加；梗阻性黄疸时增高的NO通过抑制Fas、Caspase-3的表达，而增强Bcl-2、NF-κBP65的表达而起到抑制肝细胞凋亡的作用。 WP=97 本研究的主要创新点是，首次研究了NO对梗阻性黄疸肝细胞凋亡的影响，证明了梗阻性黄疸时肝细胞凋亡是损伤肝细胞的重要途径，梗阻性黄疸时增高的NO具有抑制肝细胞凋亡的作用，上述结果为明确梗阻
【图文】：

肝细胞,附图,苏木素,肝细胞凋亡

78附图 1 S 组肝细胞无肿胀、坏死，肝细胞索排列整齐HE×200附图 3 S 组肝脏组织肝细胞有少量的凋亡 TUNELDAB 染色苏木素浅染×100附图 2 O7组肝细胞水肿，肝细胞脂肪变性，肝内小胆管增生、扩张 HE×200附图 4 O7组见肝细胞凋亡较多 TUNEL DAB 染色苏木素浅染 ×400

肝细胞,小胆管,脂肪变性,肝内

78附图 1 S 组肝细胞无肿胀、坏死，肝细胞索排列整齐HE×200附图 3 S 组肝脏组织肝细胞有少量的凋亡 TUNELDAB 染色苏木素浅染×100附图 2 O7组肝细胞水肿，肝细胞脂肪变性，肝内小胆管增生、扩张 HE×200附图 4 O7组见肝细胞凋亡较多 TUNEL DAB 染色苏木素浅染 ×400
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R575

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