MicroRNA-200c对大鼠肝星状细胞间质—上皮逆转分化（MET）的调控作用

发布时间：2020-05-09 21:28

【摘要】：目的：肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化和肝癌必经的病理过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是引起肝纤维化发生发展过程的关键细胞,激活的HSC可发生上皮-间质的转分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)。EMT是肝纤维化和肝硬化的早期阶段,这一阶段是可以逆转的。针对如何引导激活的HSC发生间质-上皮(1mesenchymal to epithelial transition, MET)逆转分化的研究,将对肝纤维化的治疗具有重要的临床意义。目前对HSC发生EMT的调控机制的研究尚不十分明确,近年来MicroRNAs对EMT的调控作用越来越引起国内外学者的关注。本实验应用乙醛激活HSC-T6,脂质体lipofectamine2000瞬时转染MicroRNA-200c(miR-200c)mimics,采用ELISA试剂盒检测各组细胞分泌物Ⅰ型胶原蛋白(TIMP I)和纤维粘连蛋白(FN)含量的变化,采用Western-blot检测细胞内上皮钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、Smad3、ZEB1(?)ZEB2蛋白表达量的变化,同时采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术检测Smad3、 ZEB1(?)ZEB2在mRNA水平表达量的变化。研究ZEB1/2与EMT的相关性,进一步探讨miR-200c可能以ZEB1/2为作用靶点发挥对HSC-T6发生MET的调控作用。方法：本实验分为两个部分。(1)第一部分,实验随机分为乙醛刺激组(T组)和对照组(C组),应用含有10%胎牛血清HDMEM培养基体外培养HSC-T6,同步化处理细胞12h,乙醛刺激组给予乙醛(终浓度200μmol/L)刺激,刺激时间为24h,对照组用等量培养基补齐。①分别提取T组和C组的细胞上清液用ELISA试剂盒检测细胞分泌物TIMPⅠ和FN的含量变化。②应用Western-blot技术检测细胞内E-cadherin(?)vimentin表达量的变化。(2)第二部分,使用10%胎牛血清DMEM培养基体外培养HSC-T6。实验随机分组为：miR-200c模拟物阳性实验组(miR-200c mimics)、miR-200c阴性对照组(miR-200c NC)和空白对照组(Blank)。各组分别给予乙醛(终浓度200μmol/L)刺激24h,并12h追加一次。采用脂质体转染剂lipofectamin2000进行瞬时转染。①收集各组细胞上清液检测细胞分泌物TIMPⅠ和FN含量变化,②检钡E-cadherin、vimentin、Smad3、ZEB1(?)ZEB2蛋白表达量的改变,应用Quantity One分析软件对Western-blot印迹膜上的蛋白条带灰度进行半定量分析,所得实验数据以均数士标准差(x±s)形式表示。实验结果采用SPSS17.0对各组之间进行随机分组的方差分析,P0.05,认为差异具有统计学意义。③应用RT-PCR技术检测Smad3、ZEB1和ZEB2在mRNA水平的表达量的变化。结果：(1)第一部分结果：①ELISA试剂盒检测结果显示,与C组比较,T组细胞分泌物TIMP I和FN含量明显增加,且P0.05。②应用Western-blot技术检测T组和C组E-cadherin(?)勺相对表达量分别为0.375+0.0223,0.824+0.0302；T组E-cadherin的相对表达量低于C组,P0.05。T组和C组vimentin的相对表达量分别为0.742+0.0384,0.487+0.0365；T组vimentin的相对表达量高于C组,P0.05。(2)第二部分结果：①与Blank组和1miR-200c NC组比较,miR-200c mimics组TIMP I和FN含量明显降低,差异具有统计学意义。②miR-200c mimics组E-cadherin相对表达量较其他两组高,而vimentin、Smad3、ZEB1和ZEB2相对表达量较其他两组低。③较Blank组和1miR-200c NC组,miR-200c mimics组ZEB1相对表达量相对较低,而Smad3mRNA不ZEB2在mRNA水平的相对表达量在各组之间的差异无统计学意义,P0.05。结论：①第一部分实验中,HSC-T6给予乙醛(终浓度200μmol/L)刺激24h后,HSC-T6被激活并发生由上皮细胞状态向问质细胞状态转分化(EMT)。②第二部分实验结果提示激活的HSC-T6经转染miR-200c mimics后细胞由问质状态向上皮状态发生逆转分化(EMT),同时说明了miR-200c、ZEB1和ZEB2蛋白参与了细胞MET的调控,miR-200c可能的作用靶点是ZEB1(?)ZEB2。实验结果进一步表明miR-200c通过抑制ZEB1(?)ZEB2表达量而参与对EMT的调控,而这种抑制作用主要表现在蛋白水平上。
【图文】：

蛋白,灰度值,技术检测,细胞蛋白

采用终浓度 200μmol/L 为乙醛刺激细胞，12h 追加一次，观察各组细胞蛋白的表达量用 Quantity one 分析目的蛋白条带的灰度值，vimentin 蛋白灰度值与相应内参 βactin 蛋白条到 E-cadherin 和 vimentin 蛋白的相对表达量E-cadherin 蛋白的相对表达量为 0.375±0.0 223的相对表达量为 0.824±0.0 302，且 P<0.05，差2a,b）。1.2 Western blot 技术检测 E-cadherin 和 vime

细胞内,转染,蛋白,脂糖

图 5 转染后，激活的 HTC-T6 细胞内 E-cadherin、vimentin、 Smad3、ZEB2 的蛋白相对表达量Fig.5 Afer transfecton,the relative expreeion of E-cadherin,vimentin,Smad3,ZEBin actived HSC-T6 cells2.3 转染后 RT-PCR 技术检测 Smad3、ZEB1 和 ZEB2 在 m平的表达量2.3.1 总 RNA 质量的鉴定用总 RNA 提取试剂盒（离心柱型）提取细胞内总 RNA，通分光光度仪（NanoDrop ND-1000）测量所提取总 RNA 的浓度测得的 A260/280 值为在 1.8-2.0 之间，，浓度均大于 200 ng/μ脂糖凝胶电泳跑胶结果（如图 10）显示，28S 和 18S 条带清
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2

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