TGF-β1及靶向Smad3基因shRNA慢病毒对大鼠肝细胞系BRL-3A增殖的作用

发布时间：2020-05-10 15:11

【摘要】：目的探讨TGF-β1对大鼠肝细胞系BRL-3A增殖的影响,并进一步通过靶向大鼠Smad3基因shRNA慢病毒沉默TGF-β1下游的SMAD3蛋白,再次观察BRL-3A增殖的变化,初步研究TGF-β1对BRL-3A增殖影响的作用机制,为以后设计基于TGF-β1通路、以促进肝再生为治疗目的的相应研究奠定基础。方法(1)MTT法检测TGF-β1对细胞增殖的影响：将BRL-3A细胞分为6组,分别给予不同浓度的TGF-β1(0、2、4、6、8、10ng/ml),检测各组细胞24h、36h、48h时的增殖活性；(2)进一步将BRL-3A细胞分为TGF-β1处理组和对照组,分别给予和不予TGF-β1 (8ng/ml),进行如下检测：①流式细胞仪检测两组细胞24h、36h、48h时的凋亡情况和细胞周期分布；②实时定量RT-PCR检测两组细胞24h、36h、48h时CyclinE、Cdk-2、EGF、HGF、Bcl-2、C-myc、MMP9、NF-κB基因的表达变化；(3)包装并滴定靶向大鼠Smad3基因shRNA慢病毒,以MOI=5感染BRL-3A,用实时定量RT-PCR和Western-blot分别检测Smad3 mRNA和SMAD3蛋白的表达,以鉴定该慢病毒沉默BRL-3A中SMAD3表达的功能；(4)以正常BRL-3A和靶向Smad3基因shRNA慢病毒感染后的BRL-3A各为1组,用MTT法检测两组细胞的增殖活性,流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布,实时定量RT-PCR检测两组细胞CyclinE、Cdk-2、EGF、HGF、Bcl-2、C-myc、MMP9、NF-κB基因的表达变化。结果(1)MTT结果显示,各浓度TGF-β1组在24h、36h、48h时的细胞增殖活性差异均无统计学意义；(2)流式细胞仪分析结果显示,TGF-β1处理组24h、36h、48h时的细胞凋亡率较对照组有所上升,但统计学未显示明显差别；同时,细胞周期分布与对照组间的差异也无统计学意义；(3)实时定量RT-PCR发现,TGF-β1处理组相对于对照组,CyclinE mRNA、Cdk2 mRNA、EGF mRNA在24h时分别下调至0.194±0.103、0.181+0.064、0.634±0.116倍,36h时分别下调至0.379+0.173、0.457±0.123、0.619±0.112倍,48h时分别上调至1.956+0.215、2.17+0.471、7.66+0.437倍；HGF mRNA在24h、36h、48h时均明显下调,分别至0.152±0.068、0.146+0.053、0.158±0.061倍；Bcl-2 mRNA在24h、36h时无统计学差异,48h时上调至1.567±0.115倍；C-myc mRNA、MMP9 mRNA、NF-κB mRNA在3个时刻均上调,24h时分别至1.742±0.389、3.484±0.411、1.625±0.369倍,36h时分别至2.292±0.361、1.563±0.323、1.486±0.494倍,48h时分别至2.499±0.475、2.233±0.493、3.612±0.364倍。以上基因表达差异均有统计学意义(P0.05)；(4)包装并滴定靶向Smad3基因shRNA慢病毒获得了具有感染活性的慢病毒颗粒,滴度为2.75×107Tu/ml,以MOI=5感染BRL-3A的感染率为98.59%。实时定量RT-PCR发现,病毒组相对于正常组Smad3mRNA下调至0.340±0.153倍(t=17.169,P=0.000), Western-blot显示病毒组SMAD3表达较正常组明显减低,差异有统计学意义(t=7.042,P=0.002)；(5)MTT和流式细胞仪分析发现正常组和病毒组间的吸光值及细胞周期分布差异均无统计学意义。实时定量RT-PCR发现,病毒组相对于正常组CyclinEmRNA、Cdk-2mRNA、MMP9mRNA分别下调至0.093±0.032、0.083±0.02、0.039+0.005倍,P值分别为0.030、0.002、0.001,而EGFmRNA、HGFmRNA、Bcl-2mRNA、C-mycmRNA、NF-κBmRNA表达变化均无统计学意义。结论大鼠肝细胞系BRL-3A对TGF-β1促凋亡和细胞周期阻滞作用的敏感性低下,可能与非Smads途径的激活,NF-κB、Bcl-2、C-myc、MMP9表达的上调有关。阻断TGF-β1/Smads通路下游的SMAD3蛋白后BRL-3A并未表现出增殖活性的改变,NF-κB、Bcl-2、C-myc表达也未发生有统计学意义的改变,进一步说明非Smads途径可能是TGF-β1影响BRL-3A增殖的重要途径。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575

【参考文献】