核苷（酸）类似物抗HBV感染的临床研究以及病毒耐药突变对其免疫原性的影响

发布时间：2020-05-10 11:33

【摘要】：乙型肝炎病毒感染是全球关注的卫生难题。研究证实，乙型肝炎病毒感染与肝炎肝硬化和肝细胞癌高度相关，通过有效的抗病毒治疗,可以阻断或延缓这一进程。核苷（酸）类似物的应用使慢性乙型肝炎的治疗出现了革命性的变化。然而，由于核苷（酸）类似物在抗乙型肝炎病毒感染领域的上市应用时间很短，国内外对亚洲慢性乙型肝炎人群口服核苷（酸）类似物抗病毒治疗效果的综合评价较少，而且鲜见对乙型肝炎病毒基因耐药突变危险因素的大样本、多因素研究，对于一些特殊耐药突变株（如rtA181T）的生物学和免疫学特点以及临床意义也存在较大争议。目前，国内已批准上市的用于抗乙型肝炎病毒感染的核苷（酸）类似物主要有四种，即拉米夫定、阿德福韦、替比夫定和恩替卡韦。本课题即荟萃分析了这四种核苷（酸）类似物抗病毒的疗效，研究了核苷（酸）类似物抗病毒过程中易导致病毒突变的危险因素，比较了病毒突变后不同挽救措施的效果，并对rtA181T/sW172*耐药突变的生物学特点和临床意义进行了探讨，以期促进临床抗病毒治疗的合理化，为医务人员及时准确地预测耐药产生并进行有效干预提供有价值的参考。本课题首先采用循证医学的方法，对拉米夫定、阿德福韦、替比夫定和恩替卡韦初治HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者1年的效果进行了荟萃分析。计算机检索了PubMed（1966年—2011年3月）、Embase（1966年—2011年3月）、CBMdisk（1978年—2011年3月），CNKI（1994年—2011年3月）、万方数据库（1998年—2011年3月）等中英文数据库，，共检索到2018篇文献，经筛选和评价后最终纳入16篇研究文献，然后应用ReviewManager4.2软件分析数据并绘制森林图。结果显示，在HBV DNA阴转率方面，恩替卡韦的效果优于拉米夫定（P=0.001）和阿德福韦（P0.00001）。在HBeAg阴转率方面，替比夫定的效果优于拉米夫定（P=0.02）和阿德福韦（P=0.02），而且在抗-HBe转换率方面的效果优于恩替卡韦（P=0.001）。恩替卡韦和替比夫定的疗效优于其它两种核苷（酸）类似物；替比夫定在促进e抗原阴转方面的优势尤为明显。在第二部分，本课题对828例应用核苷（酸）类似物治疗的慢性乙型肝炎患者病毒聚合酶区基因耐药变异的情况进行了影响因素分析，影响因素具体包括：性别、年龄、诊断、基因型、HBeAg、HBV DNA水平、ALT值、AST值、TBil值以及药物。单因素和多因素分析结果均显示，年龄、血清HBVDNA水平、HBeAg（-）以及应用拉米夫定或阿德福韦治疗（以恩替卡韦为参照）是影响病毒聚合酶基因区突变的危险因素。年龄越大（OR=1.585，P0.05）、HBV DNA水平越高（OR=1.369，P0.05），病毒突变的可能性越大；与恩替卡韦相比，拉米夫定（OR=12.593，P0.05）和阿德福韦（OR=3.737，P0.05）两种药物导致病毒突变的可能性都较大；HBeAg为（-）时（OR=1.775，P0.05），病毒突变的可能性较大。在第三部分，本课题比较了拉米夫定耐药后四种不同挽救策略的效果，四种策略包括：换用阿德福韦；换用恩替卡韦；加用阿德福韦；更换为阿德福韦和恩替卡韦联合治疗。共有338例拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者纳入本研究。结果显示，挽救治疗持续过程中，该四种策略导致的病毒耐药率分别为23.65%（49/207）（平均持续18个月）、18%（9/50）（平均持续17个月）、6.94%（5/72）（平均持续23个月）和0%（0/9）（平均持续18个月），P0.05。在突变类型方面，单独rtA181V/T突变的发生率最高，其在换用阿德福韦治疗组的发生率为34.69%（17/49）。结果表明，加用阿德福韦或更换为阿德福韦和恩替卡韦联用的方式应作为治疗的优选策略；对于目前存在争议的换用恩替卡韦的补救措施，因其较高耐药率的发生不推荐作为拉米夫定耐药的挽救策略。在第四部分，本课题探讨了HBV多聚酶/逆转录酶基因区与S基因重叠突变株rtA181T/sW172*对HBsAg/抗-HBs的影响，以确定该突变的生物学特点和临床意义。通过体外比较rtA181T/sW172*突变株与野生株转染HepG2细胞的培养上清液中HBsAg的表达情况，结果证实，该突变株可以造成HBsAg的分泌障碍；然而，通过比较rtA181T单独突变患者与RT区未检测出目前已知耐药突变患者的血清HBsAg和抗-HBs水平发现，两组患者血清HBsAg的中位水平（前者为3865.52Coi，后者为3442.58Coi）以及抗-HBs的中位水平（前者为2IU/L，后者也为2IU/L）均无统计学差异（前者P=0.69，后者P=0.35）；通过对比rtA181T突变发生前后同一患者的血清HBsAg和抗-HBs水平发现，突变后的患者血清HBsAg（突变后与突变前的差值均数2444.57Coi，P0.05）和抗-HBs水平都没有下降。结论认为，由于患者体内存在的少量HBV野生株分泌的HBsAg代偿了因突变造成的HBsAg分泌障碍，rtA181T/sW172*突变造成的HBsAg截短不会影响体内血清HBsAg的水平，因此也对临床上新近开展的以血清HBsAg定量判定抗病毒效果的方法几乎没有影响；此外，该突变不会影响HBsAg的抗原性。
【图文】：

森林图,治疗效果,阿德福韦,抗-HBe

夫定（LdT）与恩替卡韦（ETV）1 年治疗效果比较的森林图3.2.5 恩替卡韦（ETV）与阿德福韦（ADV）共有 6 个研究比较了 ETV 和 ADV 初治 HBeAg 阳性慢性乙型肝炎患者 1年的效果（图 5）。结果显示，ETV 在 HBV DNA 阴转率（RR=1.73；RR 的 95%可信区间为 1.38-2.17；P<0.00001）和 ALT 复常率（RR=1.25；RR 的 95%可信区间为 1.06-1.49；P=0.009）方面均优于 ADV，但两者在 HBeAg 阴转率（RR=0.77；RR 的 95%可信区间为 0.44-1.35；P=0.36）和抗-HBe 转换率方面的差别无统计学意义（RR=0.74；RR 的 95%可信区间为 0.28-1.94；P=0.53）。16

多聚酶,耐药,位点,吸尽

图 6 HBV 多聚酶/逆转录酶基因区耐药位点图（引自[1]）2.2 检测方法2.2.1 HBV 聚合酶基因区（RT 区）序列检测和分析（1）HBV DNA 的提取取患者血清标本 100μl，加入病毒 DNAout 试剂（四川绵阳天泽基因工程有限公司）300μl；旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂 QL-901）振荡 30s，室温静置 10min，再振荡 30s；置于离心机（ThermoElectron Corporation）15000g 离心 10s 后加入异丙醇 350μl，再旋涡振荡 30s，15000g 离心 15min 后充分吸尽液体，加入 75%乙醇 500μl，15000g 离心 5min后充分吸尽液体；室温放置 8min，晾干，加入 80μlTris（自配）充分溶解病毒 DNA。（2）HBV RT 区扩增将完全包括整段 RT 基因（nt 130-1161）的 HBV基因片段（nt 54-1278）用巢式 PCR 方法进行 2 轮扩增。第一轮扩增的上游引物为 UP3（nt 3146-3167）：5’-AGTCAGGAAGACAGCCTACTCC-3’，下游引物为 DOWN1（nt 1577-1596）：5’-AGGTGAAGCGAAGTGCACAC-3’；反
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】