Notch与TGF-β信号通路串话在乙醛激活肝星状细胞中的作用

发布时间：2020-05-12 12:04

【摘要】： 目的：肝星状细胞(HSC)激活增殖并转分化为成纤维母细胞是导致肝纤维化的主要病理机制之一。多条细胞信号转导途径参与了HSC的激活增殖与转分化过程的调控。乙醛是激活HSC并导致酒精性肝纤维化发生的关键分子。本实验以大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)为研究对象,采用乙醛激活HSC-T6增殖并转分化,并分别使用特异性阻断剂SB-431542和DAPT阻断TGF-β/ALK5和Notch两条信号通路,观察TGF-β/ALK5和Notch信号通路在肝星状细胞活化中的作用,进而探讨两条信号通路之间的“串话”及其对肝星状细胞活化的调控,为阐明Notch信号通路在肝纤维化中的作用及其分子机制提供实验依据。方法：①HSC的培养及处理：HSC分为对照组和乙醛刺激组,每组又随机分为4组。对照组包括空白组、TGF-β阻断组(SB-431542 10μmol/L)、Notch阻断组(DAPT 200nmol/L)和TGF+Notch阻断组(SB-431542 10μmol/L+DAPT 200nmol/L)。实验组包括单纯乙醛刺激组、TGF-β阻断+乙醛刺激组、Notch阻断+乙醛刺激组和TGF阻断+Notch阻断+乙醛刺激组。各组细胞培养至融合度70%-80%时,0.4%胎牛血清DMEM培养基同步化处理细胞12h后,更换为完全培养基。对照组用对应的抑制剂处理培养,刺激组在对应的抑制剂预处理1h后给予乙醛刺激(200μmol/L)刺激,每12h补加一次,刺激24h。24h后收集各组细胞、细胞培养基上清液并行细胞爬片。②RT-PCR:利用TRIzol法提取细胞总RNA,紫外分光光度法检测总RNA浓度及纯度,根据操作流程用M-MLV逆转录试剂盒进行逆转录反应得到cDNA,琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,Quantity One软件分析结果。③Western blot:裂解细胞并提取总蛋白,考马斯亮蓝G-250法蛋白定量。SDS-PAGE后半干式电转移至PVDF膜。电转移结束后PVDF膜用洗膜缓冲液TBST洗涤3×5min,封阻缓冲液(5%BSA)在室温下密闭轻摇动封阻1h。洗涤3×5min,PVDF膜与Ⅰ抗稀释液室温下轻摇动孵育2h,洗涤3×5min。PVDF膜与Ⅱ抗稀释液于室温下轻摇动孵育1h,洗涤3×5min。加入ECL化学发光试剂A、B液各0.5ml,混匀,润透PVDF膜后室温作用1min。暗室中将PVDF膜迅速封入保鲜膜中,Kodak X-ray film压片,放射自显影5min。X-ray film置于显影液中15-30sec,定影液中1.5min,清水冲洗晾干。Quantity One软件分析结果。④检测指标：VG染色检测HSC增殖的形态学改变；MTT法检测细胞增殖；ELISA法检测TIMPⅠ和FN；RT-PCR方法检测HSC中RBP-JK、Hes1和Smad3的mRNA水平；Western blot检测HSC-T6中RBP-JK、Hes1、Smad3和a-SMA.的蛋白水平。结果：①HSC活性和增殖的变化：VG染色发现乙醛刺激明显促进HSC贴壁及重叠、明显促进HSC增殖和显著增加胶原纤维蛋白的表达。MTT检测结果发现乙醛刺激明显增强HSC活性(P0.05),培养至72h时,细胞活性达最高峰。表明乙醛刺激作用可增强HSC活性。特异性阻断剂SB-431542或DAPT预处理阻断乙醛刺激对HSC活性的上调(P0.05),SB-431542和DAPT协同作用也有效阻断乙醛刺激对HSC活性的上调(P0.05)。②TIMPI和FN表达变化：ELISA结果表明乙醛刺激组较对照组TIMP I和FN的表达明显上调(P0.05),说明乙醛刺激明显增强HSC中TIMPI和FN表达。特异性阻断剂SB-431542或DAPT预处理几乎阻断乙醛刺激对TIMP I和FN的上调作用(P0.05),但是未发现两种阻断剂存在协同作用。③RBP-JK、Hes1和Smad3表达及活性的变化：RT-PCR和Western blotting检测结果显示,乙醛刺激对RBP-JK的表达无显著性上调(P0.05),表明乙醛刺激对Notch通路节点分子RBP-JK无明显上调作用；TGF-β和Notch通路阻断均导致RBP-JK下调(P0.05),二者同时阻断对RBP-JK的下调作用明显强于TGF-B和Notch通路单独阻断(P0.05),表明TGF-β通路对Notch通路节点分子RBP-JK有调控作用。在同时阻断两条通路时可能出现协同作用,又RBP-JK是Notch通路的上游靶点,说明TGF-B通路与Notch通路的胞内段NICD的直接作用,实现两个信号通路之间的相互“对话”。RT-PCR和Western blotting检测结果显示,乙醛刺激显著上调Hes1表达(P0.05),TGF-β和Notch通路阻断对乙醛刺激引起的Hes1上调均有明显的抑制作用(P0.05),且二者协同阻断的抑制作用更为明显(P0.05)。上述表明乙醛刺激对Notch通路中Hes1有明显上调作用,且TGF-B通路对Notch通路节点分子基因Hesl具有调节作用,TGF-B通路和Notch通路在Hes1的调节中具有协同作用。RT-PCR和Western blotting检测结果显示,乙醛刺激空白组较对照空白组Smad3的mRNA水平有明显上调(P0.05),表明乙醛刺激对Smad3转录水平有显著性上调。TGF-β和Notch通路阻断明显下调乙醛刺激对Smad3转录水平的上调(P0.05),表明乙醛刺激后,TGF-β通路与Notch通路对Smad3转录水平的调节具有协同作用。但总Smad3蛋白条带无明显差异性改变(P0.05),具体原因有待后续实验阐明。Western blotting检测结果显示,乙醛刺激显著促进p-Smad3-S425水平(P0.05),Notch单阻断组或TGF-β和Notch双阻断组都明显抑制乙醛刺激导致的p-Smad3-S425上调(P0.05),且双阻断较单阻断的抑制作用明显(P0.05),显示TGF-β阻断对Notch阻断具有协同作用。④a-SMA表达的变化：Western blotting检测结果显示,乙醛刺激明显促进a-SMA表达(P0.05),表明乙醛刺激能上调TGF-β通路的活化导致效应蛋白a-SMA表达；TGF-B和Notch通路阻断明显抑制乙醛刺激对a-SMA的上调(P0.05)。在乙醛刺激刺激时,双阻断组较TGF-β阻断组对a-SMA表达上调的抑制作用明显(P0.05),表明显示二者阻断剂具有协同作用。结论：①乙醛刺激可明显激活HSC,促进HSC增殖及转分化；②SB-431542和DAPT均可明显拮抗HSC活化增殖与转分化,即拮抗HSC的纤维化；③Notch信号通路对乙醛刺激HSC活化具有明显调节作用；乙醛刺激后TGF-B通路对Notch通路节点分子RBP-JK、Hesl有明显调控;TGF-β与Notch信号通路间存在"cross-talk",CSL(RBP-JK)可能是两条途径串话的“交叉点”,而Hesl是信号途径的直接靶点
【图文】：

图1培养72h的大鼠(Rat)肝星状细胞A对照组培养72h的大鼠(Rat)肝星状细胞(xloo);B.对照组培养72h的大鼠(Rat)肝星状细胞(x200);C.乙醛刺激组培养72h的大鼠(Rat)肝星状细胞(x100);D.乙醛刺激组培养72h的大鼠(Rat)肝星状细胞(x200)Fig.1HePatiestellateeells峨er72hourscuituringA.HePatiestellatecellsineontrolgrouPafter72如ursculturing(x100);B.HePatiestellateeellsincontrolgrouPafter72hoursculturi五g(x200)C.HePatiestellatecellsinaeetaldehydest加ulationgrouPafter72hoursculturing(x100)D.H叩atiestellateeellsinacetaldehydestlinulationgrouPa丘er72hourscultu血g(x200)大鼠(Rat)肝星状细胞(HSC)经72h培养后，生长达到>98%丰度。经含铁的苏木素染色，细胞内质呈淡蓝黑色，外质收缩，剩下部分不着色或色泽更浅。圆形细胞核呈蓝黑色。居中的核仁呈黑色小圆点。细胞生长旺盛，胞体丰满，折光性强，表现出良好的生长状态。

2.2ELISA法检测1型胶原蛋白(TIMPI)、纤维粘连素(FN)大鼠(Rat)肝星状细胞培养36h后，按组加入TGF一B阻断剂SB一431542(终浓度1咖mol/L)、Notch阻断剂DAPT(终浓度Zoonmol/L)预处理1h，对照组继续培养24h;乙醛刺激组预处理lh，，在加入乙醛刺激剂(终浓度20伽mol几)培养24h后。酶标仪检测各组OD值，利用回归计算公式计算各组含量得EUSA测定结果。显示:加入阻断剂后I型胶原蛋白(TIMPI);纤维粘连素(FN)明显下调，单阻断组间含量基本一致，但双阻断组与单阻断组比较可见明显下调。结果见表5、图6A(TIMPI)及图6B(FN)。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2

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本文编号：2660193