双链RNA对细胞凋亡和HBV复制的影响及细胞黏附对药物诱导凋亡的影响

发布时间：2020-05-13 12:28

【摘要】：研究表明,长双链RNA会引发干扰素(interferon ,IFN)防御途径的激活,从而激活双链RNA依赖蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR),使其与长双链RNA结合形成二聚体,一方面磷酸化真核细胞翻译起始因子(eukaryotic Initiation Factor-2 alpha,eIF-2α),抑制蛋白质合成,导致细胞凋亡;另一方面,磷酸化转录因子NF-KappaB的抑制因子,使NF-KappaB活化,引起IFN相关刺激因子启动子激活,导致IFN转录增加。为研究长双链RNA诱导细胞凋亡的机制,我们以长双链RNA、短双链RNA分别转染HepG2.215细胞后,定量RT-PCR检测干扰素表达、DNA Fragmentation ELISA检测凋亡。结果表明,长双链RNA使细胞中IFN表达水平上调,凋亡增加,而短双链RNA不会引起IFN水平的上调和凋亡。 RNA干扰(RNA Interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA( Double- stranded RNA, dsRNA)在细胞内特异性的降解同源mRNA,致靶基因的表达沉默。dsRNA进入细胞,在Dicer的切割下生成21-23nt的短链dsRNA,即小干扰RNA(Small Interfering RNA, siRNA),随后结合核酶复合物形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC ),RISC识别同源性的mRNA并将其降解。我们选取长双链RNA(即dsRNA)、短双链RNA(即siRNA)转染HepG2.215细胞,ELISA测得细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,与对照组相比,HBsAg、HBeAg含量降低,说明通过RNAi可以抑制HBV的复制。在前述的转染过程中我们发现,细胞贴壁更紧密时,后续转染过程测定的凋亡率低于贴壁不紧密的细胞组。因此,我们推测细胞的黏附强弱不同会影响细胞的凋亡。为证实假设,我们选用IFN、5-氟尿嘧啶分别诱导经不同处理因素作用后的HepG2、HEK293细胞,实验发现,经多聚赖氨酸预处理后的培养板,会增强细胞的贴壁生长能力,使细胞对药物的敏感性下降,增殖抑制率、凋亡率均下降;而在细胞未贴壁时加入Fn抗体阻断基质中重要成分-纤维粘连蛋白(Fn)后,会使细胞对药物的敏感性增加,增殖抑制率、凋亡率均上升;IFN作用不同黏附作用处理后的细胞组,Western检验其PKR水平均升高,但组间无明显差异。综合前述各项研究和我们的实验可得出:1.dsRNA会激活PKR系统,引起细胞的凋亡,又能介导RNAi,抑制HBV的复制2.siRNA不能激活PKR系统,也不引起细胞的凋亡,但能介导RNAi,抑制HBV的复制。3.干扰细胞-基质的黏附作用可以增强IFN、5-氟尿嘧啶的敏感性,从而使细胞增殖受抑,凋亡增加。4.IFN可以增强PKR的磷酸化水平,但并不受黏附作用的影响。
【图文】：

正义,反义链,单链,转染

2-1-1 HBs 单链 RNA 正义链和反义链的合成(800bp)Figure2-1-1 Reaction to generate senseand antisense HBs-ssRNALane1 RNA markerLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNA图2-1-2 LacZ单链RNA正义链的合成(1000bp)Figure2-1-2 Reaction to geneand antisense LacZ-ssRNLane1 RNA markeLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNeal-time RT-PCR 检测 dsRNA 转染的 HepG2.215 细胞mRNA 的表达水平eal-time RT-PCR 检测显示：HBs-dsRNA 转染组、LacZ-dsRNA 转染达量分别是空白转染组的 3.15 倍和 3. 54 倍，呈显著上调。3.63.73.8evelsl

正义,反义链,单链,转染

【参考文献】