microRNA在肝纤维化和肝细胞癌中表达及作用研究

发布时间：2020-05-13 12:23

【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤,但是目前为止除手术切除外,缺乏有效的防治手段。而且HCC的早期诊断率、早期发现率很低,临床上大多数患者发现时已处于疾病的中晚期,失去了早期治疗的机会。因此,如何对HCC有效的治疗和尽早的预防一直以来都是研究的热点与难题。肝纤维化是慢性肝病的病理基础,而HCC往往在慢性肝病的基础上发展而来,因此肝纤维化也是HCC的重要病理基础。HCC及肝硬化均是肝脏病变进展到不可逆阶段,但是肝纤维化阶段是可逆的,如果有效阻断甚至逆转肝纤维化,则慢性肝病、肝硬化及HCC便可获得良好的预防效果。microRNA在肿瘤的发生发展中有着重要作用,超过1/3的人类蛋白编码基因均受microRNA的调控。并且已有的研究显示,microRNA能够反映出疾病发生发展密切相关的分子本质,能够运用于疾病的发病机制研究、诊断、分子分型、治疗及预后的判断,具有极大的研究潜力。同时运用microRNA与mRNA对接研究的方法可以大大提高microRNA靶基因预测的准确性,便于寻找目的靶基因。本课题分别从HCC的早期预防——探讨肝纤维化发病机制的角度以及探索HCC新的治疗方法角度,运用microRNA或mRNA表达谱筛选的方法,对差异表达的RNA进行生物信息学分析,为HCC的早期预防及有效治疗提供新的依据。本研究分二个部分。第一部分:肝窦内皮细胞毛细血管化相关的microRNA及靶基因研究目的:筛选出在肝窦内皮细胞(LSEC)毛细血管化过程中差异表达的mRNA和microRNA,并进行生物信息学分析,根据分析结果挑选靶基因进行组织学验证,为深入探讨肝窦内皮毛细血管化的关键基因提供前期依据。方法:体外持续培养人原代肝窦内皮细胞(HHSEC),在扫描电镜下观察培养过程中窗孔结构的维持情况。根据窗孔的有无进行分组,随后提取mRNA进行mRNA及microRNA表达谱芯片研究,将研究结果进行生物信息学分析及对接研究,挑选差异明显的靶基因进行临床大样本验证。结果:通过体外培养HHSEC的方法可以观察到窗孔结构由有至无的变化,我们提取相应mRNA进行mRNA和microRNA表达谱芯片。mRNA表达谱芯片结果显示,1639个基因出现表达上调、1608个基因表达出现下调。其中,有532个mRNA差异显著。microRNA表达谱芯片筛选出了与HHSEC毛细血管化相关,P0.05,差异显著的microRNA共19个,其中表达上调的microRNA共7个,表达下调的microRNA共12个,并通过生物信息学分析方法获得了 10109个靶基因信息。进一步将mRNA与microRNA研究结果进行对接分析,结果获得253个共同的靶基因。根据这253个靶基因差异倍数大小挑选出差异显著的一个——CALM2进行临床组织样本免疫组化验证,结果显示CALM2在LSEC的表达水平与肝纤维化的程度成正比,证实该靶基因与肝纤维化有关。结论:结合HHSEC mRNA及microRNA表达谱芯片筛选及生物学分析结果获得与HHSEC毛细血管化相关的靶基因,并证实该靶基因的蛋白表达与肝纤维化程度成正比,为深入探讨肝纤维化发病机制及逆转措施提供了有力的实验依据。第二部分:调控肝细胞癌中Glypican-3表达的microRNA研究目的:筛选出HCC中与Glypican-3(GPC3)表达相关的microRNA,并进行生物信息学分析,根据分析结果挑选差异显著的microRNA进行组织学验证,为深入探讨GPC3在HCC表达的发生机制提供RNA依据。方法:将有完整临床病理学资料的HCC样本进行GPC3组织学免疫组化及mRNA检测,并据此分为GPC3阳性组和GPC3阴性组,进行microRNA表达谱芯片研究。将研究结果进行生物信息学分析,挑选差异明显的microRNA进行临床扩大样本验证。结果:根据GPC3表达情况进行分组后,microRNA表达谱芯片筛选出信号值500共有25个差异表达的microRNA,其中10个microRNA表达上调,15个microRNA表达下调。随后挑选出5个microRNA进一步qPCR扩大样本量验证,成功筛选出了 4个差异表达microRNA(miR-99a-5p,miR-125b-5p,miR-376c-3p,miR-17-5p),并通过生物信息学分析方法获得了相关的GO和信号通路信息。结论:运用microRNA表达谱芯片和qPCR扩大样本量验证的方法成功筛选出了 HCC中GPC3相关的microRNA,并通过生物信息学分析为后续实验研究提供可靠的实验数据。结论:肝纤维化及HCC的形成过程中有大量microRNA和靶基因的共同参与,我们通过microRNA或mRNA表达谱分析,筛选出了在各自过程中差异显著的microRNA及mRNA,并利用生物信息学分析方法获得了相关靶基因和信号通路信息,同时进行临床验证,为深入研究提供前期基础。
【图文】：

注：ＣＰ－１、ＣＰ－２代表原代ＨＨＳＥＣ；邋Ｃｈｈｌ、Ｃｈｈ２代表培养３周后的ＨＨＳＥＣ。逡逑２．２邋ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ完整性分析逡逑琼脂糖凝胶电泳观结果（图１．２）见３条电泳条带，由上向下依次为２８Ｓ、１８Ｓ核逡逑糖体ＲＮＡ及低分子量ＲＮＡ。２８Ｓ和１８Ｓ核糖体ＲＮＡ条带明显、锐利，提示各组逡逑ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ完整性较好，符合芯片实验要求。逡逑ＣＰ－１邋ＣＰ－２逦Ｃｂｈ．１逦Ｃｈｈ２逡逑■逡逑■Ｂｒ逡逑图１．２邋ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ电泳结果图（标记代表的组别见前）逡逑３．邋ＨＨＳＥＣ邋Ａｇｉｌｅｎｔ全基因组芯片及ｍｉｃｒｏＲＮＡ芯片杂交逡逑ＨＨＳＥＣ邋Ａｇｉｌｅｎｔ表达谱芯片及ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达谱芯片由Ｇｅｎｅｐｉｘ邋４０００Ｂ焚光扫描逡逑２１逡逑

华中科技大学博士学位论文逡逑仪扫描后，生成ＴＩＦＦ格式图片。每个样本重复３次（图１．３）。结果良好。逡逑ＣＰ－１逡逑ＣＰ－２逡逑Ｃｈｈｌ逡逑Ｃｈｈ２逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2;R735.7

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本文编号：2661953