RUNX3基因多态性与溃疡性结肠炎相关性研究

发布时间：2020-05-14 09:21

【摘要】： 溃疡性结肠炎(UC)是一种病因不明的慢性肠道非特异性炎症性疾病,发病机制不详,一般认为是由包括感染在内的环境因素作用于具有多个基因缺陷的易感倾向个体,诱发异常免疫反应而导致疾病。西方国家发病率较高,亚洲发病率较低,但是近年来国内发病率逐年攀升。既往的流行病学研究显示UC具有遗传易感性,主要在不同人种的发病率、家族聚集现象、双生子的研究中得到证实。近年来,基因连锁分析确定了多个IBD易感基因的染色体座位,被称为IBD1-IBD7;进而,发现了多个UC的易感基因,并在不同人群中得到证实,例如SLC22A4和SLC22A5基因的多态性与CD和UC均有相关性,在意大利人群和英格兰高加索人群中相继得到重复。但是,UC是一个多基因遗传疾病,其基因型与临床表型之间存在纷繁复杂的关系;并且由于遗传异质性的存在,特别是东西方人群之间的差异,很多西方的研究成果在东方无法得到重复,因此,寻找具有普遍性的IBD易感基因无可避免地成为目前研究的方向。近年来RUNX结构域转录因子家族成员与自身免疫性疾病的相关性开始引起关注,nature genetics杂志相继报道了与类风湿性关节炎、银屑病及系统性红斑狼疮相关的易感基因,这些基因SNP位点的共同特征是均位于Runx1蛋白的结合区,从中我们可以看出自身免疫紊乱的表象下面蕴含着共同的分子机制,Runxs蛋白家族成员在自身免疫性疾病的发病机制中可能均发挥着重要作用。RUNX3是Runt结构域转录因子家族成员,位于染色体1P36.1,对炎症性肠病的特定易感人群的研究发现其染色体1P36存在基因紧密连锁和连锁不平衡现象。另外,Ori Brenner等人在研究中发现RUNX3基因敲除小鼠在4周龄时均自发发生溃疡性结肠炎。这些均提示RUNX3在溃疡性结肠炎的发病机制中可能具有重要作用,但是RUNX3及其直接调控的下游基因的基因多态性是否与溃疡性结肠炎相关还不明确,本课题将对此进行探讨。目的: 1、明确RUNX3的表达与溃疡性结肠炎是否相关;2、筛选RUNX3调控的下游基因,预期从中找出与溃疡性结肠炎易感性密切相关基因;3、检测我国汉族人群中RUNX3及其下游基因的多态性与UC的相关性。方法: 1、收集68例UC患者病变部位结肠粘膜组织及50例结肠癌患者手术后标本两端的正常粘膜组织,用免疫组织化学方法检测RUNX3在结肠粘膜组织中的表达情况。2、通过染色质免疫共沉淀-启动子芯片(CHIP-chip)技术筛选RUNX3调控的下游基因,从中找出与溃疡性结肠炎易感性密切相关基因;3、采用PCR-SSP技术,对80例UC患者以及153例健康对照的RUNX3基因(rs2236851,C/T)、SLC22A4(rs3792876,C/T)及PPAR-γ(rs3892175,A/G)的遗传多态性进行分析。数据统计使用SPSS软件进行χ2检验分析。结果: 1、利用免疫组化技术检测了68例UC患者及50例正常粘膜组织中RUNX3的表达,发现RUNX3在溃疡性结肠炎患者的肠粘膜中的表达阳性率为76.5% (52/68),对照组粘膜的阳性率为66.0%(33/50),经过χ2检验进行比较,UC组与对照组间无显著差别(P0.05),且RUNX3的表达与UC患者的性别、年龄、病情程度及病变部位无关。 2、利用染色质免疫共沉淀技术,得到SGC7901细胞中受到RUNX3直接调控的基因片段,纯化后送基因芯片公司,经荧光探针的制备、芯片杂交、图像采集和数据分析等步骤,以两组信号强度的比值大于2作为判定标准,结果得到698个可能受到RUNX3直接调控的基因。其中PPAR-γ基因与UC的关系密切,成为我下一步研究关注对象之一。 3、RUNX3基因rs2236851C/T位点在我国人群中存在遗传多态性,UC组T等位基因频率为18.49%,明显高于对照组(7.75%),可能与UC相关(P=0.001)。UC组RUNX3基因型分布为TT型0%,TC型36.99%,CC型63.01% ;对照组为TT型0%,TC型15.49%,CC型84.51%;其差异具有统计学意义(P0.05)。因此RUNX3的rs2236851位点可能与UC的遗传易感性相关。SLC22A4基因(rs3792876C/T)及PPAR-γ基因(rs3892175A/G)在我国人群中存在多态性,但与UC的发病无显著相关。结论: 本研究发现①RUNX3在溃疡性结肠炎患者的肠粘膜中的表达与对照组相比无显著差别,但RUNX3基因rs2236851C/T位点在我国人群中存在遗传多态性,且与我国汉族人群UC的发病有相关性。②SLC22A4基因(rs3792876 C/T)在我国人群中存在多态性,但与UC的发病无显著相关。③PPAR-γ基因(rs3892175A/G)在我国人群中同样存在多态性,但与UC的发病无显著相关。
【图文】：

基因结构

图2 RUNX3 的基因结构（引自Gene，2001）RUNX3 是一个近年新发现的肿瘤抑制基因，其活性受各种信号通路调控，磷酸化、乙酰化和遍在蛋白化作用对Runx3 的翻译后修饰很重要，影响其稳定性和活性。启动子异常甲基化在RUNX3 基因的表达调控、DNA修复、基因稳定及基因抑制方面起着重要作用。启动子异常甲基化阻碍了转录因子与DNA之间的相互作用而抑制了转录，使与细胞增殖和分化有关的基因表达异常，细胞对正常分化过程的调节失控，导致肿瘤的发生。Runt结构域转录因子与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应，TGF-β是一个多功能生长因子，对机体许多生长和生理进程有重要的调控作用，其受体属于单次跨膜受体，活性TGF-β可以通过与有丝氨酸/苏氨酸活性激酶的跨膜受体TGF-β受体I和Ⅱ(TβRI和TβRⅡ)结合，诱导这两种受体产生活性的异四聚体复合物(TβRC)，，从而产生细胞内生物效应[123]，此过程中Smad蛋白起着重要的作用。TGFβ信号转导通路的配体、受体和胞内信号转导分子

电泳图,质量控制,电泳图,探针

2、启动子芯片结果经染色质免疫共沉淀后的样品，送往北京博奥生物有限公司，经过GLAS扩增后，进行质量鉴定复合要求（图2），进行芯片杂交、图像采集、数据分析后，以两组之间信号强度的比值大于2 为判定标准得到698个可能受到RUNX3直接调控的基因(图3)；下表列出了其中信号强度排列靠前的25个基因（表1）。其中的PPARγ基因与溃疡性结肠炎的关系密切，值得我们进一步研究。lane1：DNA markerlane2：input 样品lane3：阴性对照样品lane4：ChIP 产物样品M 1 2 3070417图 2、探针扩增后杂交前的电泳图（质量控制）-50-
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R574.62

【参考文献】