以肝星状细胞为靶点的N1-乙酰基取代吡咯烷类化合物A5抗肝纤维化作用研究

发布时间：2020-05-15 06:47

【摘要】：研究背景：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种慢性肝脏疾病发生发展的共同病理基础,是形成肝硬化的必经病理阶段。肝纤维化的实质是肝脏细胞外基质(ECM)的过度沉积,其中心环节是处于静止期的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化和向肌成纤维样细胞、成纤维细胞的转化,导致大量细胞外基质的合成；与此同时,细胞外基质的降解减少,由此导致了其合成与降解的不平衡促进了肝纤维化的形成。因此抑制激活的HSCs细胞的活化、增殖及促进HSCs细胞的凋亡成为治疗肝纤维化的重要途径。目的：CIP-A5是基于基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的结构而设计的N1-乙酰基取代吡咯烷类化合物的衍生物,一直被视为一种治疗肝硬化的候选化合物。本实验以体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)为研究对象,观察CIP-A5对HSC-T6细胞株的增殖、凋亡及相关纤维化细胞因子的影响,从分子生物学水平阐明CIP-A5抗纤维化的作用机制。方法： 1.明胶酶活性筛选实验：化合物活性筛选实验,以琥珀酰明胶降解法检测化合物CIP-A5对人Ⅳ型胶原酶活性抑制作用；以SDS-PAGE明胶酶谱分析HSC-T6细胞培养上清液MMP-2、MMP-9水平,评价化合物对酶活性的影响。 2.化合物CIP-A5对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响：研究CIP-A5抗肝纤维化作用,分别采用MTT法观察其对HSC-T6生长抑制作用；采用流式细胞术观察其诱导HSC-T6细胞凋亡的影响；以台盼蓝染色法,检查化合物处理后蓝染细胞的比例,评价化合物对肝星状细胞抑制作用性质。 3.化合物CIP-A5对大鼠肝星状细胞相关纤维化细胞因子表达水平的影响：以免疫印迹法检测CIP-A5对活化的肝星状细胞HSC-T6中MMP-2、MMP-9及相关纤维化细胞因子TGF-p、TNF-α、CTGF的表达水平,评估CIP-A5作为一种新型化合物用于抗肝纤维化作用的可能。结果：CIP-A5浓度在5-30ng/ml范围内,与明胶酶直接孵育30min,明胶酶的激活作用从28.4%增加到126.7%；与HSC-T6细胞接触24h后,CIP-A5(1-100μ/ml)对培养上清中MMP-2的活性由38.6%提高至190.5%,MMP-9的活性由22.4%增加至170.0%；在与TGF-p共同孵育后,CIP-A5对培养上清中MMP-2的活性由30.0%增加至169.5%,MMP-9的活性由21.4%增加至170.0%；以Western blot分析发现该化合物对活化的MMP-2的表达量由50%提高到160.8%,MMP-9的表达量也由30.0%增加至109.5%；CIP-A5(1-100μg/ml)经过72h共同孵育,TIMP-1的表达抑制率分别为10.6%,32.8%,51.7%,67.3%及79.5%；在与系列浓度的CIP-A5(1-100μg/ml)共同孵育72h后,TGF-β与TNF-α的表达呈剂量依赖性降低,其中TGF-p的表达抑制率从15.7%增加至50%；TNF-α的表达抑制率从32.8%增加至160%；CTGF抑制率分别为15.3%,26.8%,41.5%,68.6%以及79.1%。结论：化合物CIP-A5能够抑制由TGF-β诱导的肝星状细胞的活化和增殖；能够提高和增强明胶酶活性,降低TIMP-1、TGF-β1、TNF-α、CTGF的表达,从而发挥抗肝纤维化作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2

【参考文献】