慢性乙型肝炎耐药患者外周血单个核细胞HBV cccDNA耐药相关基因突变特点研究

发布时间：2020-05-16 12:28

【摘要】：已有研究支持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)存在感染患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)等肝外组织的现象,并且在其中检测到乙型肝炎病毒抗原及HBV DNA的复制。HBV共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)作为HBV基因组的原始复制模板,是HBV持续感染的关键因素。HBV的病毒学特性是影响其感染转归和抗病毒疗效的最根本的原因,HBV cccDNA虽然量少,但十分稳定,是HBV慢性感染以及抗病毒药物停用后病情反复的主要因素。所以对cccDNA的检测便成为了解HBV能否在体内继续复制的重要环节,国内外学者设计和建立了一些HBV cccDNA的检测方法,通过各种PCR技术、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)等实验室手段能够对PBMCs中的cccDNA进行定性及定量检测。 近年核苷(酸)类抗病毒药物的广泛长期使用带来了棘手的耐药问题,已成为临床抗病毒疗效欠佳或失败的主要原因。关于临床上经核苷(酸)类似物治疗并产生耐药突变的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA是否同样存在类似的耐药突变特点及其是否具有复制潜能,尚未见相关研究报道。本研究利用核苷(酸)类药物选择作用下产生的特定耐药突变作为分子标签,重点比较分析了样本血清HBV DNA和PBMCs HBV cccDNA RT区耐药相关突变的差异以及对PBMCs中HBVcccDNA复制力进行测定,研究结果将有助于理解HBV肝外感染及耐药相关机制。 目的分析经核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清病毒中产生耐药突变的慢性乙型肝炎患者PBMCs由HBV cccDNA的基因突变特点及其是否具有复制表达能力。 方法检测分析了30例慢性乙型肝炎患者,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中产生耐药突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30例并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(Plasmid-SafeTM ATP-dependent DNase, PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析rtM204I、rtM204V、rtN236T、rtA181V、rt184、rt202或rt250等多个位点的核苷(酸)类似物耐药相关突变。另外将扩增的PBMCs中HBV cccDNA全长基因组克隆到pGEM-Teasy载体中,经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切释放的1.0倍HBVcccDNA全长基因组纯化后,转染入HepG2肝癌细胞,72小时后定量检测HBsAg及核心颗粒DNA,分析PBMCs中HBV cccDNA全长基因组的自然复制力。 结果30例样品中16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,且PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBV DNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%；C基因型11例,占68.8%,与用血清HBV检测分型结果一致；但与血清HBV均检出耐药突变不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药突变的野生株。4例慢性乙肝患者中有3例从PBMCs中成功获得全长cccDNA基因组的6条克隆进行复制力检测,通过ELISA法检测上清HBsAg及实时定量PCR检测核心颗粒DNA水平,表明其具有复制表达能力。 结论经核苷酸类似物抗病毒治疗的慢乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,且转染入体外细胞的HBV cccDNA证明可以完成复制周期,即PBMCs中的cccDNA具有复制表达能力,推测PBMCs可能为体内HBV野生株的一个“存储库”,并通过cccDNA的形式稳定保存HBV的原始野生株。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】

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1 宋闽宁,骆梅兰,黄文琪;乙肝病毒携带者外周血单个核细胞培养上清液HBV-DNA定量检测意义[J];中国医师杂志;2003年04期

2 赵克开,缪晓辉;乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义[J];中华肝脏病杂志;2005年04期

3 吴凤婷;吕其军;;肝病患者血清中HBVcccDNA检测的临床意义[J];肝脏;2007年04期

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本文编号：2666736