高迁移率族蛋白B1抑制剂防治肝纤维化的实验研究

发布时间：2020-05-16 15:51

【摘要】：高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)是30年前发现的一种核内非组蛋白。以往的研究主要集中于它在细胞核内的作用。近年来研究发现HMGB1可在LPS、IL-1、TNF-α等刺激下由单核/巨噬细胞释放,也可通过各种组织的坏死细胞漏逸到细胞外,释放到细胞外的HMGB1可与RAGE、TLR4等多种受体结合,发挥相应的生物学作用。而各种原因导致肝脏炎症或坏死均可使HMGB1释放到细胞外,活化TLR4等受体,而TLR4通路被证实是肝脏纤维化形成机制的关键节点。基于以上理论,考虑HMGB1在肝脏纤维化形成机制中也可能扮演重要角色。目的:本研究首先通过选择白求恩国际和平医院及石家庄市第五医院行肝穿刺患者作为研究对象,检测不同程度肝纤维化患者血清HMGB1水平,探讨肝纤维化程度和HMGB1水平之间的关系,并进一步通过构建小鼠四氯化碳肝纤维化模型来验证HMGB1在肝纤维化形成中的作用,以及探讨采用HMGB1抑制剂正丁酸钠阻止HMGB1合成或释放是否可延缓肝纤维化进展,希望为临床阻止肝纤维化进展提供新的策略和途径。方法: 1临床病例的搜集:随机选择2008年12月至2010年6月年龄为18~58岁不同程度慢性乙型病毒性肝炎及肝硬化患者73例,诊断标准符合2005年中华医学会感染病分会、中华医学会肝病学分会和中国肝炎防治基金会联合颁布的《慢性乙肝防治指南》,排除其它肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、肿瘤等疾病后作为入组病例,其中男性54例、女性19例,平均年龄34.6±10.35岁,G1- G 2组43例、G3-G4组30例、S1-S2组34例、S3-S4组39例,同时选择12名健康人作为对照,其中男性5例、女性7例,平均年龄33.1±9.6岁,空腹抽血进行肝功能、血清HMGB1水平检测,患者在超声引导行肝脏活组织病理检查,了解肝纤维化程度,综合上述数据分析,明确HMGB1水平与肝纤维化程度的关系,了解HMGB1在肝纤维化形成中的作用。 2 HMGB1抑制剂防治肝纤维化的实验研究:清洁级雄性BALB/C小鼠50只,体重18~24 g,随机分为正丁酸钠预防组20只,给予40%CCL4(橄榄油稀释),2 mL/kg,每周二、五行腹腔注射,同时给予1.5%正丁酸钠喂水共70天,模型组20只仅给予40%CCL4(橄榄油稀释)腹腔注射,2 mL/kg,每周二、五行腹腔注射,正常对照组10只每周二、五给予0.9%生理盐水2 mL/kg行腹腔注射,三组均在用药后70天处死,留取血清备用,通过酶联免疫吸附(ELISA)技术检测HMGB1水平、肝功能,部分肝组织固定于4%多聚甲醛中,用于免疫组化检查,明确肝脏在受到损伤后,HMGB1的移位情况,部分肝组织冻存于-80度冰箱中,用于Western blot检测,了解HMGB1的表达情况。结果: 1慢性肝病患者HMGB1水平与炎症活动度的关系:健康对照组HMGB1水平为16.86±3.48 ng/mL,G1- G 2组为26.54±5.31 ng/mL,G3-G4组为33.64±8.35 ng/mL。慢性肝病患者HMGB1水平较健康对照组明显升高,三组组间比较均有显著性差异(P0.01),G3-G4组明显高于G1- G 2组(P0.01)。 2慢性肝病患者HMGB1水平与纤维化程度的关系:健康对照组HMGB1水平为16.86±3.48 ng/mL,S1-S2组为28.83±7.53 ng/mL、S3-S4组为30.0±7.61 ng/mL,健康对照组与S1-S2组、S3-S4组均有显著差异(P0.01)。S1-S2组与S3-S4组比较无显著差异(P0.05)。 3慢性肝病患者HMGB1水平与肝功能的关系:血清HMGB1水平与ALT(r=0.2566,P0.05)、AST(r=0.4719,P0.01)均呈显著正相关,与ALB(r=0.114,P0.05)、TBIL(r=0.141,P0.05)无明显相关。 4正丁酸钠干预对小鼠血清HMGB1水平的影响:采用CCl4造模成功后检测血清HMGB1水平较对照组明显升高,全程给予正丁酸钠干预可显著降低血清HMGB1水平,其中模型组为30.75±7.43 ng/mL,干预组为25.54±3.97 ng/mL,组间比较具有显著差异(P0.01)。 5正丁酸钠干预对炎症活动分级及纤维化程度的影响:给予CCl4造模70天处死小鼠,模型组炎症活动度G1-G2级4只,G3-G4级10只,干预组G1-G2级13只,G3-G4级6只,组间比较具有显著性差异(χ2=5.125,P0.05)。模型组纤维化程度S1-S2期3只, S3-S4期11只,而干预组S1-S2期12只, S3-S4期7只,组间比较差异明显(χ2=5.661,P0.05)。 6小鼠肝组织病理HE及天狼猩红染色:在模型组可见正常肝小叶结构被破坏,肝细胞索排列紊乱,肝细胞大量坏死,可见假小叶形成;干预组肝小叶结构大部分被保留,可见纤维间隔形成,但未见典型假小叶形成。 7小鼠肝组织免疫组化:对照组肝组织内HMGB1主要表达于有核细胞核内,胞质内有少量表达,细胞间组织未见表达。模型组不仅在胞内可见HMGB1的表达,在组织间隙可见广泛分布的片状染色,且多位于炎症较重或存在组织坏死的区域。与模型组相比,干预组组织间HMGB1的表达水平明显降低。 8小鼠肝组织Western blot结果:与正常对照相比,模型组肝组织HMGB1表达水平显著升高,而在干预组HMGB1表达水平较模型组显著下降。 9正丁酸钠干预对小鼠死亡率的影响:在70天造模过程中,模型组有6只小鼠死亡,死亡率为30%,而干预组仅有1只小鼠死亡,死亡率为5%,具有统计学意义(P0.01)。结论: 1肝纤维化患者血清HMGB1水平较健康对照明显升高,且与肝组织炎症活动度密切相关,可能是启动肝脏炎症后纤维化进程的重要原因。 2小鼠CCL4肝纤维化模型肝内和血清中HMGB1水平均显著上升,且与肝组织炎症和纤维化程度呈显著正相关。 3抑制CCL4小鼠肝纤维化模型HMGB1的合成和释放可减轻肝脏炎症活动度及肝纤维化程度,延缓肝纤维化进展,降低死亡率。 4 HMGB1抑制剂正丁酸钠可显著降低肝纤维化小鼠模型肝内和血清中HMGB1水平,改善组织学和预后,可能是肝纤维化防治的潜在靶点。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2

【参考文献】