具核梭杆菌通过非定植途径引起母婴分离大鼠肠道菌群紊乱并加剧内脏高敏感

发布时间：2020-05-16 17:52

【摘要】：研究背景肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种以腹痛和排便习惯改变为特征的功能性胃肠道疾病,其发病机制复杂,一般认为与内脏高敏感、胃肠动力异常、精神心理应激、脑-肠轴功能障碍、免疫系统激活和肠道菌群紊乱等因素有关。尽管对于肠道微生物与IBS之间的关联有越来越多的共识,但是IBS中的特异性微生物特征仍然难以捉摸。多项研究表明,肠道菌群与IBS特征性的内脏高敏感有关,例如,益生菌可以有效缓解IBS患者的症状,IBS患者的粪便移植到无菌小鼠中可以诱发内脏高敏感。其中,梭杆菌属在母婴分离大鼠粪便菌群中的相对丰度与其内脏敏感性程度存在相关性。梭杆菌属下的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)可表达多种致病因子,在结直肠肿瘤、炎症性肠病、阑尾炎组织中含量升高,参与了多种消化系统疾病的致病过程。内脏敏感性升高可见于多种动物应激模型,其中,母婴分离大鼠模型的肠道菌群紊乱特征与IBS存在相似性。因此,本研究使用母婴分离大鼠模型探究具核梭杆菌对内脏敏感性和肠道菌群的影响和机制。目的1.探讨具核梭杆菌对正常大鼠和母婴分离大鼠内脏敏感性的作用。2.探讨具核梭杆菌对正常大鼠和母婴分离大鼠肠道菌群的影响。3.探讨具核梭杆菌在肠道内的定植情况及其影响因素。方法1.构建动物模型:将32只雄性SD大鼠分为母婴分离造模大鼠(n=16)和正常喂养大鼠(n=16)。母婴分离组大鼠在出生后2至14天内每天母婴分离3小时(上午9时至12时),正常喂养组大鼠不作处理。大鼠断奶后,将上述两组大鼠分别随机分为具核梭杆菌灌胃组和生理盐水灌胃组,即所有大鼠被分为4组:D组(母婴分离和具核梭杆菌灌胃),M组(母婴分离和生理盐水灌胃)、F组(具核梭杆菌灌胃)、N组(生理盐水灌胃)。灌胃操作分别在第4、5、6、7、8周,D组和F组大鼠的具核梭杆菌灌胃量为109CFU,灌胃体积根据大鼠体质量确定(1ml/100g),M组和N组在相同时间点以等体积的生理盐水灌胃。2.内脏敏感性测定:在大鼠12周龄时,通过向固定于大鼠结直肠内的球囊中注射不同体积生理盐水(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6ml),观察各组大鼠对结直肠扩张(colorectal distension,CRD)的不同反应,记录腹壁撤回反射(abdominal withdraw reflex,AWR)评分。为了衡量每只大鼠的内脏敏感性程度,将球囊体积为0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml时的AWR评分相加,作为内脏敏感性指数(visceral hypersensitivity index,VHI)进行统计分析。3.粪便菌群检测:收集大鼠在第3、8、12周末的粪便样本保存于-80℃。提取粪便DNA后进行16S rRNA基因测序,分析各组的肠道菌群变化。4.具核梭杆菌特异性IgA检测:该部分借鉴蛋白印迹法。收集SD大鼠在第3、8、12周末的粪便样本以适当体积生理盐水稀释(lg/7ml),离心后取上清作为一抗备用。收集具核梭杆菌重悬于生理盐水中,超声破碎法获得具核梭杆菌总蛋白。将等量的高浓度菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳,蛋白分离后转移至PVDF膜,用牛奶封闭后,依次置于大鼠粪便上清、辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,,HRP)标记的山羊抗大鼠IgA alpha链抗体中进行孵育,ECL发光液显色曝光。大肠杆菌BL21(DE3)用同样的方法作为对照。5.抗原鉴定与验证:将SDS-PAGE电泳后的具核梭杆菌蛋白进行考马斯亮蓝染色,选取与特异性条带位置一致的蛋白进行鉴定。构建FomA基因的重组大肠杆菌,诱导其分泌重组蛋白后,超声破碎获得细菌总蛋白,按前述方法检测大鼠粪便上清中针对重组大肠杆菌的特异性IgA,并对考马斯亮蓝染色后的凝胶进行蛋白鉴定。结果1.内脏敏感性评价:4组大鼠的内脏敏感性指数存在统计学差异。D组和M组大鼠的内脏敏感性分别高于F组和N组,D组大鼠内脏敏感性高于M组,差异均有统计学意义,F组和N组大鼠内脏敏感性之间的差异无统计学意义。2.肠道菌群改变:具核梭杆菌灌胃和母婴分离造模均造成了大鼠肠道菌群的紊乱,二者均可降低大鼠肠道菌群的多样性,造成菌群结构改变,但是各组均未检测到具核梭杆菌的定植。3.特异性IgA抗体检测与抗原鉴定:第3周时,各组条带颜色均较浅;第8、12周时,D组和F组在40kDa和130kDa处出现明显条带,而M组和N组在该位置的条带颜色较浅。大肠杆菌BL21(DE3)用作对照后发现,蛋白条带颜色浅且条带位置组成均不相同。因此可初步认为大鼠肠道内产生了较多针对具核梭杆菌特异性的IgA抗体。蛋白质鉴定结果显示在40 kDa和130 kDa处均检测出由FomA基因编码的蛋白。FomA基因重组大肠杆菌以同样方法行蛋白印迹实验后,相比于普通大肠杆菌,在40 kDa处出现了明显条带,蛋白鉴定也确认了 FomA蛋白的存在,即FomA蛋白是引起特异性IgA产生的抗原成分。结论1.具核梭杆菌灌胃可以加剧母婴分离大鼠的内脏敏感性,但是不能使正常大鼠的内脏敏感性升高。2.具核梭杆菌灌胃和母婴分离造模均可引起大鼠肠道菌群紊乱,具核梭杆菌灌胃可通过非定植途径引起肠道菌群的结构改变。3.具核梭杆菌灌胃使大鼠肠道内特异性IgA分泌增多,其中,IgA可以特异性识别具核梭杆菌FomA蛋白。
【图文】：

曲线,粪便,大鼠,样本

３００８９２２条序列纳入最终分析。其中序列最少的样本获得２３５２２条序列。使用Ｕｓｅａｒｃｈ逡逑软件结合ＲＤＰ数据库，对测序数据进行分析，按照０．９７相似性获得１２３９各ＯＴＵ。各逡逑样本稀释曲线（图２）均到达平台期，提示测序深度足够。逡逑Ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅｓ逡逑Ｉ逦——３Ｄ逡逑—逦逦＊逦一邋３Ｍ逡逑１逡逑0邋！邋！邋；邋：逡逑１０．０００逦２０邋０００逦３０．０００逦４０．０００逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｒｅａｄｓ邋Ｓａｍｐｌｅｄ逡逑图２．大鼠粪便样本稀释曲线。“３Ｄ”表示Ｄ组在第３周时的样本，以此类推。逡逑２．２大鼠肠道菌群多样性分析逡逑通过比较大鼠肠道菌群的Ｓｈａｎｎｏｎ指数对大鼠肠道ko群多样性进行分析。在第３周时，逡逑母婴分离大鼠和正常词养的大鼠在Ｓｈａｎｎｏｎ指数上的差异无统计学意义（ｘ＝邋２．２７，邋ｄｆ＝邋１，逡逑／３邋＝邋０．１３，１＜：１＇１１５１＾丨－＇＾１１丨５检验，图３八）。第８周时，４个组的大鼠肠道菌群存在差异，总体逡逑差异有统计学意义＝邋１０．２９２６，邋ｄｆ＝邋３，逦０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ检验，图３Ｂ），各组两两比逡逑较后发现，Ｄ组、Ｆ组、Ｍ组的Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于Ｎ组，差异有统汁学意义（Ｐ＝０．０１２，逡逑Ｐ＝０．０１２，邋／Ｍ）．００９，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ检验），，也就是说，在第８周时Ｄ、Ｆ、Ｍ组的肠道菌逡逑群多样性相比ＦＮ组降低。第１２周时

菌群,指数,时间点,大鼠

通过比较大鼠肠道菌群的Ｓｈａｎｎｏｎ指数对大鼠肠道ko群多样性进行分析。在第３周时，逡逑母婴分离大鼠和正常词养的大鼠在Ｓｈａｎｎｏｎ指数上的差异无统计学意义（ｘ＝邋２．２７，邋ｄｆ＝邋１，逡逑／３邋＝邋０．１３，１＜：１＇１１５１＾丨－＇＾１１丨５检验，图３八）。第８周时，４个组的大鼠肠道菌群存在差异，总体逡逑差异有统计学意义＝邋１０．２９２６，邋ｄｆ＝邋３，逦０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ检验，图３Ｂ），各组两两比逡逑较后发现，Ｄ组、Ｆ组、Ｍ组的Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于Ｎ组，差异有统汁学意义（Ｐ＝０．０１２，逡逑Ｐ＝０．０１２，邋／Ｍ）．００９，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ检验），也就是说，在第８周时Ｄ、Ｆ、Ｍ组的肠道菌逡逑群多样性相比ＦＮ组降低。第１２周时，各组大鼠的Ｓｈａｎｎｏｎ指数存在差异，总体差异有统逡逑计学意义（？（＝邋１０．１２７８，邋￡＾＇＝３，尸＝０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ检验，图３Ｃ），各组两两比较后可知，逡逑２３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

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