酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖在DSS诱导的结肠炎小鼠中的作用探究

发布时间：2020-05-17 08:51

【摘要】：研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种消化道慢性非感染性炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),它们以黏液脓血便为主要临床症状。近年来其发病率一直呈持续上升趋势,因其症状发作与缓解反复交替,给病人带来了巨大的痛苦和经济负担。经过多年研究,IBD的确切发病机制仍不十分清楚,但目前学者普遍认为肠道微生态失衡及肠道免疫功能失调在其发病过程中起着重要作用。肠道微生态包括细菌、真菌、病毒等,而目前关于肠道微生态的研究都集中在细菌及其代谢产物方面,关于真菌在IBD中的作用的研究则较少,但已有的研究均表明真菌与IBD密切相关。酿酒酵母是一种广泛应用于生产生活的真菌,最新研究发现在树突状细胞(Dendritic cells,DC)和CD4~+T细胞共培养中酿酒酵母不仅不会诱导辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)的分化,其细胞壁中的甘露聚糖还可以诱导调节性T细胞分化(regulatory T cell,Treg)。Treg细胞在IBD中发挥着重要的抑炎作用,因此酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖能否通过促进结肠炎小鼠中Treg细胞的分化来抑制炎症值得进一步探究。目的给予Balb/c小鼠自由饮用DSS溶液建立结肠炎模型,应用提取自酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖对其进行干预,探究酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖能否改善DSS诱导小鼠结肠炎症反应,检测小鼠结肠组织中Foxp3和RORγt在蛋白水平的表达,探究酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖对结肠组织中Th17细胞和Treg细胞分化的影响。方法(1)实验动物分组:同批次SPF级雄性Balb/c小鼠48只,随机分为正常对照组、DSS模型组、DSS+甘露聚糖组、甘露聚糖组,每组12只。(2)实验处理:(1)正常对照组:自由进食水,不做特殊处理。(2)DSS模型组:自由进食水,第8天将饮水更换为2.75%DSS溶液,每两日更换DSS溶液。(3)DSS+甘露聚糖组:自由进食水,第8天将饮水更换为2.75%DSS溶液,每两日更换DSS溶液,同时从第1天开始每日给予每只小鼠甘露聚糖50mg/kg/d灌胃。(4)甘露聚糖组:自由进食水,同时从第1天开始每日给予每只小鼠甘露聚糖50mg/kg/d灌胃。(3)每日监测小鼠体重并观察小鼠活动情况,观察大便性状以及有无血便,记录数据。(4)当DSS模型组出现明显体重下降及严重血便时终止实验,处死所有小鼠,收集血清,留取结肠组织。(5)根据小鼠体重变化、大便性状以及是否有血便等行疾病活动度(disease activity index,DAI)评分,根据结肠组织HE染色结果行组织学损伤指数(Histological index)评分,酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中IL-10、IL-17A表达,免疫组织化学法检测结肠组织中Foxp3表达,Western Blot检测结肠组织中Foxp3、RORγt表达。(6)数据处理:使用SPSS 21.0软件对数据进行方差同质性检验,然后采用单因素方差分析对各组间数据进行处理,检验水准为α=0.05,当P0.05时认为两组数据之间存在显著性差异,具有统计学意义。结果(1)各组小鼠疾病活动度评分:与正常对照组相比,DSS组均出现明显的体重下降、稀便及血便;DSS+甘露聚糖组体重下降程度较DDS组轻,炎症反应也较轻。DSS组DAI评分明显高于正常对照组,DSS+甘露聚糖组DAI评分则低于DSS组,差异均具有统计学意义(P0.05)。甘露聚糖组与正常对照组无明显差异。(2)各组小鼠HI评分:与正常对照组相比,DSS组结肠黏膜出现腺体消失,上皮细胞损伤,隐窝破坏及炎性细胞浸润等。DSS+甘露聚糖组黏膜损伤程度较DDS组轻。甘露聚糖组与正常对照组未见黏膜损伤及炎症反应。DSS组HI评分高于正常对照组,DSS+甘露聚糖组HI评分低于DSS组,差异均具有统计学意义(P0.05)。(3)各组小鼠血清中IL-10、IL-17A的表达:(1)DSS+甘露聚糖组血清中IL-10水平高于DSS组,二者差异具有统计学意义(P0.05),正常组和甘露聚糖组无明显差异(P0.05)。(2)DSS组血清中IL-17A水平高于DSS+甘露聚糖组,二者差异具有统计学意义(P0.05),甘露聚糖组和正常组无明显差异。(4)各组小鼠结肠组织中Foxp3、RORγt表达:(1)DSS+甘露聚糖组结肠组织中Foxp3水平高于DSS组,二者差异具有统计学意义(P0.05),正常组和甘露聚糖组无明显差异。(2)DSS组结肠组织中RORγt水平高于DSS+甘露聚糖组,二者差异具有统计学意义(P0.05),甘露聚糖组和正常组无差异。结论(1)酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖可以缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症反应;(2)酿酒酵母细胞壁中的甘露聚糖可以诱导Treg细胞分化并促进IL-10分泌,抑制Th17细胞分化及IL-17A分泌。
【图文】：

注：*：与正常对照组相比，P＜0.05 ＃：与 DSS 模型组相比，P＜0.05图 1 各组小鼠 DAI 评分2 各组小鼠结肠长度DSS+甘露聚糖组小鼠结肠长度大于 DSS 模型组，且差异具有统计学意义。甘露聚糖组与正常对照组无明显差异，评分结果见表 4、图 2。表 4 各组小鼠结肠长度Group Colon lengthcontrol 9.47±0.41DSS 5.87±0.54*DSS+mannan 7.00±0.64*#mannan 9.50±0.41#注：*：与正常对照组相比，P＜0.05 ＃：与 DSS 模型组相比，P＜0.05

注：*：与正常对照组相比，P＜0.05 ＃：与 DSS 模型组相比，P＜0.05图 2 各组小鼠结肠长度3 各组小鼠组织学损伤指数正常对照组：结肠黏膜完整，上皮细胞连接紧密，无破损，隐窝结构正常，腺体排列规整，未见炎性细胞浸润；DSS 模型组：结肠黏膜破损，上皮层完整性破坏，隐窝结构异常，表现为数量减少，结构不规则，基底部可见淋巴细胞、浆细胞浸润；DSS+甘露聚糖组：结肠黏膜基本完整，上皮细胞损伤及隐窝破坏等较 DSS模型组轻；甘露聚糖组：黏膜完整，隐窝结构及形态正常，与正常对照组无明显差异。DSS+甘露聚糖组小鼠 HI 评分低于 DSS 模型组，，且差异具有统计学意义。甘露聚糖组与正常对照组无明显差异，评分结果见表 5，HE 染色结果见图 4。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574.62

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