一氧化氮、一氧化碳在肝硬化门静脉高压中的作用研究

发布时间：2020-05-19 09:35

【摘要】：目的：一氧化氮(NO)与一氧化碳(CO)是两种重要的气体信使分子，体内分别由一氧化氮合成酶(NOS)和血红素合酶(HO)催化生成，可能参与肝硬化门脉高压及高动力循环的形成过程。本研究的目的旨在检测NOS-NO系统和HO-CO系统在大鼠肝硬化模型的肝硬化不同阶段静脉血清NO及CO浓度以及肝组织内NOS及HO的表达，以探讨其在肝硬化门脉高压中的作用。方法：以四氯化碳(CCl4) 联合酒精的方法(40％CCl4 3ml／kg皮下注射，每5 天一次，首剂加倍；30％酒精为唯一饮用水：饮食采用玉米粉及猪油混合饲料)诱导肝硬化大鼠模型，在肝硬化发生过程的不同时期收集肝硬化早期组(造模第15天， 13只)、肝硬化中期组(造模第30天，11只)，肝硬化晚期组(造模第52天，11 只)血清及肝脏标本。另外收集一组正常大鼠标本作为正常对照(正常饮食及饮水， 10只)。血清标本从门静脉及下腔静脉采集并分别采用硝酸还原酶法和联二亚硫酸盐还原法测定血清NO、CO浓度。部分肝组织标本制备石蜡切片，以免疫组化ABC 法观察iNOS、HO-1、 HO-2在肝脏内的定位，并用计算机图像分析技术半定量监测其蛋白表达的强弱，灰阶值越低说明表达越强。部分肝组织标本以TRIZOL一步抽提法提取RNA，，用半定量RT-PCR技术检测iNOS、HO-1 mRNA的表达，同时检测GAPDH的表达作为内参照，采用凝胶成像分析系统半定量mRNA的表达水平，结果以目的条带与GAPDH密度比值R表示。结果：正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔静脉血中NO浓度分别为71． 088± 8． 739、 102． 821±6． 783、 122． 499±4． 605和155． 843±10． 328μ mol/L：肝硬化早期、中期和晚期大鼠下腔静脉血中NO浓度均显著高于对照组。正常及肝硬化早、中、晚期大鼠门静脉血中NO浓度分别为87． 025±7． 858、 115． 377±7． 935、 146． 222±8． 360和182． 811±8． 449μ mol／L；与对照组大鼠比较，肝硬化早期、中期以及晚期大鼠的门静脉血NO均显著增高。各组大鼠下腔静脉血与门静脉血相比，不论是对照组，还是肝硬化早期、中期、晚期大鼠，其门静脉血中NO浓度均显著高于同组大鼠的下腔静脉血NO的浓度。免疫组化结果显示肝硬化大鼠肝组织iNOS的表达阳性细胞主要是肝细胞，此外复旦大学博士学位论文存在于少量窦上皮细胞和Kupffer细胞。图像分析结果显示对照组、肝硬化早、中和晚期组的iNOS灰阶值分别为157.30士2.71、127.62士17.30、117.73士16.40和 108.00士10.68;说明各组肝硬化大鼠肝组织中iNOS的表达均显著高于对照组。对照组、肝硬化早期、中期和晚期大鼠肝组织中iNOSmRNA表达的R值分别为 0.3024士0.00449、0.4385士0.00582、0.7584士0.00759和0.8810士0.00729;各组肝硬化大鼠的肝组织中iNOSmRNA的表达均明显强于对照组。正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔静脉血中CO浓度分别为17.210士3.120、 19.862士7.598、45.136士18.625和30.064士8.470协mol/L;肝硬化中期和晚期大鼠下腔静脉血中C0浓度显著高于对照组。正常及肝硬化早、中、晚期大鼠门静脉血中C0浓度分别为17.080士5.107、 19.800士8.070、52.191士21.362和36.991士7.386pmol/L;与对照组大鼠比较肝硬化中期和晚期CO浓度显著增高。不同组的肝硬化大鼠的门静脉血和下腔静脉血中的C0浓度随着肝脏病变的逐渐加重而增高，到中期肝硬化达峰值;肝硬化晚期时，有所回落。肝硬化中期、晚期大鼠门静脉血中C0浓度明显高于下腔静脉。免疫组化结果显示各组肝硬化大鼠及对照组肝组织表达HO一1、HO一2的阳性细胞主要是肝细胞，此外见于少量窦上皮细胞和Kupffer细胞。图像分析结果显示对照组、肝硬化早、中、晚期组的HO一1灰阶值分别为155.70士4.92、138.46士6.02、 121.18士9.40和124.18士7.56，各组肝硬化大鼠的灰阶值显著低于对照组大鼠，说明各组肝硬化大鼠肝组织中HO一1的表达显著高于对照组大鼠。对照组、肝硬化早、中、晚期组的HO一2灰阶值分别为154.60士6.79、140.15士6.36、128.27士10.80、 128.27土9.36，各组肝硬化大鼠的灰阶值显著低于对照组大鼠，说明各组肝硬化大鼠肝组织中HO一2的表达显著高于对照组大鼠。对照组、肝硬化早、中、晚期大鼠肝组织中HO一lmRNA表达的R值分别为0.2798 士0.00263、0.3743士0.00473、0.6240士0.00954和0.8383士0.00694;肝硬化组肝脏HO一lmRNA的表达明显比对照组增高。结论: 1.肝硬化大鼠NO浓度在早期就升高，晚期达高峰。门静脉N0浓度明显比下腔静脉高。肝硬化大鼠肝组织iNOS表达明显上调，iNOSmRNA表达增加。 2.肝硬化大鼠血清CO浓度在中期才开始升高，晚期有所回落。肝硬化大鼠晚期门静脉血中CO浓度明显高于下腔静脉。肝硬化大鼠肝组织HO一1，HO一2表达明显上调，HO一lmRNA表达增加。 3.肝硬化大鼠及对照组肝组织内表达iNOS、HO一1、HO一2的细胞主要是肝细胞、少量的窦上皮细胞和Kupffer细胞。复旦大学博士学位论文 4.iNOS一N0系统与HO一C。系统在肝硬化门脉高压中起着重要作用。
【图文】：

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2、基因测序证实测序结果:将PCR产物置入冰袋送上海生工生物工程技术服务有限公司测序(见图1一8)。:，.1二111Ul13.CT‘CC及GC瓦C及‘及蓝C了T蓝IC‘IT肠呀及GCC及‘C了C了‘C及Ti及丁CC呀及“TC皿CI‘呀肠C图1一8:大鼠iNOS测序结果3、同源性分析:将测序结果在www.ncbi.nlm.nih.gov网站上与基因库内资料对照，同源性94%。说明PCR产物就是1NOSmRNA的目的基因。见分析结果:Seore=304bits(158)，Expeet二4e一80Identities=170八80(94%)37

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2、基因测序证实测序结果:将PCR产物置入冰袋送上海生工生物工程技术服务有限公司测序(见图1一16)。妇.14.巧.1‘.1了.rCCCC及‘l肠CTT“CI互‘GCCI!“CC!全C了‘C‘C盈l!C?了C了了C几“及CCr‘互CCC图1一16:大鼠HO一测序结果3、同源性分析:测序结果在www.ncbi.nlm.nih.gov网站上与基因库内资料对照，同源性94%。说明PCR产物就是HO一lmRNA目的片段。见分析结果:51
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R575.2

【参考文献】