PARP-1对RAW264.7细胞内HMGB1的定位和分泌的影响

发布时间：2020-05-19 12:32

【摘要】：目的:研究聚ADP-核糖基聚合酶1(PARP-1)对RAW264.7细胞内HMGB1定位和分泌的影响,从亚细胞结构来观察HMGB1由胞核向胞浆移位的过程,为研究重症急性胰腺炎的治疗提供新的策略。方法:用100ng/ml的LPS处理RAW264.7细胞1、2、4、8和16h,运用cell ELISA测定刺激后细胞内PARP-1活性变化的时间规律;用LPS(100ng/ml)、LPS+3-AB(10mmol/l)刺激RAW264.7细胞1、2、4、8和16h,运用细胞免疫荧光在荧光显微镜下观察HMGB1在细胞内定位的时间变化规律,运用Western-blot的方法检测HMGB1在细胞培养上清中的水平;构建HMGB1-EGFP(wild type, WT)的表达质粒和HMGB1NLS区域第40、47、179位谷氨酸突变为丙氨酸的HMGB1-EGFP(mutated type, MT)的表达质粒,通过瞬时转染到RAW264.7细胞中,用100ng/ml的LPS处理转染后的细胞,在荧光显微镜下观察HMGB1在细胞内定位的情况。结果: LPS刺激RAW264.7后,细胞中PARP-1活化,活性增强,在刺激后4小时达到高峰,随后活性逐渐降低;HMGB1在刺激后1h开始由胞核向胞浆移位,随着刺激时间的延长,逐渐向胞浆集聚;抑制PARP-1的活性可以减少HMGB1由胞核向胞浆的移位,抑制HMGB1向细胞外的分泌;HMGB1 NLS区域的谷氨酸突变后,不会减弱HMGB1由胞核向胞浆的移位,对HMGB1细胞内定位没有影响。结论:PARP-1参与了RAW264.7细胞内HMGB1的定位和分泌,它通过对HMGB1蛋白进行ADP-核糖基化修饰,来调控HMGB1在细胞中的定位及细胞外的分泌。HMGB1 NLS区域的谷氨酸突变对HMGB1的细胞内定位没有影响。3-AB通过抑制PARP-1的活性进而抑制HMGB1的ADP-核糖基化修饰,从而抑制HMGB1向胞浆的移位和细胞外的分泌过程。PARP-1抑制剂可以抑制HMGB1向细胞内定位和细胞外分泌,为HMGB1引起的炎症反应的治疗提供了新的思路。
【图文】：

图 1 LPS 刺激 RAW264.7 细胞后不同时间点 PARP-1 的活性变化OD 值大小代表 PARP-1 活性大小，*，P<0.05（与 0h 比较）如图 1 所示，用 LPS 刺激 RAW264.7 细胞后，PARP-1 的活性在未刺

细胞内定位,情况,细胞,胞核

图 2 LPS 刺激 RAW264.7 细胞后 HMGB1 的细胞内定位情况（×200）用免疫荧光法观察 LPS 刺激 RAW264.7 细胞后 HMGB1 在细胞内的定位规律（见图 2）。未用 LPS 刺激的对照组 RAW264.7 细胞中的绿色荧光主要定位于细胞核内。而用 LPS 刺激的实验组 RAW264.7 细胞，在刺激 1 小时后，在胞浆中即可观察到绿色荧光，随着刺激时间的延长，在刺激后 2h、4h、8h、16h，，细胞浆中的绿色荧光强度逐渐增强，而胞核的荧光强度减弱，在刺激 16h后，胞核和胞浆的荧光强度几乎相等。三、 3-AB 对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞内 HMGB1 定位的影响
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R576

【参考文献】