PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纤维化发生中的作用及罗格列酮干预的实验研究

发布时间：2020-05-19 13:34

【摘要】： 第一部分：PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纤维化形成过程中的表达及意义目的：观察核转录因子PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纤维化形成过程中的表达以及与肝星状细胞活化、TGFβ1表达的相关性，探讨其在非酒精性脂肪性肝纤维化发生中的作用。方法： 1、建立NASH肝纤维化动物模型：选用4周龄雄性Wistar大鼠(体重170～210g)60只随机分为基础饲料组(对照组，C组)、高脂饲料组(模型组，F组)，分别于喂养第8、12、16、24周4个时相点，称重后麻醉大鼠，腹主动脉取血，留取肝组织标本，部分制成石蜡切片，行HE和Masson染色；部分-70℃储存备用。 2、动态观察各组：①体重变化；②HE和Masson染色观察肝脏组织病理改变；③血清游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、甘油三脂(triglyceride，TG)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotrasferase，ALT)和天门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotrasferase，AST)的变化；④放射免疫法检测血清中透明质酸(hyaluronic,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)、CⅣ型胶原(collagen typeⅣ，CⅣ)水平；⑤免疫组织化学法检测PPARγ、KLF6、α-SMA的阳性表达率。⑥RT-PCR检测肝组织PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMA的mRNA表达；结果： 1、体重情况：各组大鼠体重随造模时间延长呈逐渐增高趋势，但同一时相点比较模型组体重均高于相应对照组(P0．05)； 2、HE和Masson染色结果：C组大鼠肝脏无异常发现；F组大鼠肝脏8周时出现单纯性脂肪肝(F2-3)的病理变化，即以小泡性为主的混合性脂肪变性，无炎症和纤维化；12周时除脂肪变性外，尚可见腺泡3带少数气球样肝细胞，小叶内炎细胞浸润，点灶样坏死，部分已演进为非酒精性脂肪性肝炎，达NASH-F(2-4)G(0-1)S0诊断标准；16周时大鼠肝组织小叶内炎症进一步加剧，汇管区亦可见炎细胞浸润，腺泡3带明显的气球样肝细胞，部分大鼠肝组织出现窦周／细胞周纤维化，达NASH-F(3-4)G(1-3)S(0-1)诊断标准；24周大鼠仍呈中-重度脂肪肝，但部分大鼠炎症程度较16周时有所减轻而均出现窦周／细胞周纤维化，尚可见明显桥接样纤维化，达NASH-F(3-4)G(0-2)S(1-3)诊断标准； 3、血清学指标：F组血清TG、FFA水平8周起明显增高，与对照组比较有统计学意义(0．71±0．08 vs 0．48±0．04；0．54±0．06 vs 0．34±0．04，P0．05)，并随高脂饮食的延长逐渐升高；12周血清AST、ALT亦开始升高与对照组比较有差异(116±7．08 vs64．88±8．58；80．23±3．40 vs 44．35±3．38，P0．05)，16周达到高峰(148．2±8．33、101．6±6．79，P0．05)，24周略有下调(138．4±9．73、90．4±7．68)； 4、血清肝纤维化指标的变化：F组12周时HA含量开始增高与对照组比较有统计学意义(86．45±11．94 vs 63．57±9．49，P0．05)，并随高脂饮食的延长逐渐升高；16周血清LN、CⅣ升高与对照组比较有统计学意义(94．15±24．43 vs 71．93±11．84；59．41±8．89vs 27．87±8．49，P0．05)，24周增高最为明显，与对照组比较差异显著(131．67±59．96 VS71．93±11．84；86．31±32．78 vs 27．87±8．49，P0．01)： 5、免疫组织化学染色：PPARγ在C组肝细胞胞核中着色浅淡，呈散在分布、弱阳性表达，F组8周时在脂肪变性明显的肝细胞核中表达开始增多，12周几乎所有脂肪变性肝细胞核均可见棕黄色表达，16周随脂肪性肝纤维化的出现，PPARγ阳性表达细胞较12周开始减少，24周PPARγ阳性表达细胞数进一步减少，染色变浅呈浅棕褐色，尤其是肝纤维化形成部位PPARγ阳性染色细胞明显减少；KLF6在C组肝脏中未见阳性表达，自12周起在脂肪变的肝细胞核中可见部分阳性表达，16、24周阳性表达逐渐增多；C组α-SMA仅在血管壁有少量表达，呈浅棕黄色染色，F组12周时，除血管壁可见阳性表达外，小叶内可见少量阳性细胞表达，呈散在分布的浅棕褐色染色，16周阳性表达细胞数开始逐渐增多，并在纤维束沉积部位着色深，24周阳性表达细胞数最多、染色深，呈棕褐色，阳性细胞多位于汇管区、肝血窦周围以及纤维间隔等处； 6、RT-PCR结果：F组大鼠8周时肝组织KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA表达与对照组比较均无统计学意义(P0．05)，12-24周KLF6 mRNA表达逐步上调，与对照组比较差异显著(0．62±0．10、1．01±0．08、0．96±0．07 vs 0．24±0．05，P0．05)，16周TGFβ1、α-SMAmRNA表达开始上调，24周达到高峰与对照组比较有统计学意义(0．62±0．19、0．91±0．07 vs 0．36±0．16；0．77±0．12、1．08±0．19 vs 0．30±0．07，P0．05)；而PPARγmRNA于高脂喂养8周即明显上调(0．84±0．07 vs 0．54±0．02，P0．05))，12周表达最为明显(1．06±0．14)，16周脂肪性肝炎明显时表达开始下降(0．73±0．01)，24周下降更为明显，与对照组比较有统计学意义(0．36±0．02 vs 0．54±0．02，P0．05)。Pearson直线相关分析发现：高脂24周NASH肝纤维化时KLF6mRNA与TGFβ1、α-SMA mRNA以及肝纤维化分级评分之间呈显著正相关(r=0．848、0．859、0．706，P0．01)。结论： 1、我们构建的NASH肝纤维化模型是研究脂肪性肝炎肝纤维化发病机制的理想模型之一； 2、高脂饮食能够诱导肝组织KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA和蛋白表达增强，且其高表达与非酒精性脂肪性肝纤维化形成关系密切，在单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎、肝纤维化进展的过程中起重要作用； 3、高脂饮食诱导NASH大鼠肝脏PPARγmRNA和蛋白表达先升高后下降，推测高脂饮食诱导肝细胞损伤使脂肪变的肝细胞代偿性合成PPARγ增加，抑制增高了的各种促炎、促纤维生成因子如KLF6、TGFβ1等的释放；而当损伤因素持续存在，损伤与抗损伤动态平衡失调后PPARγ合成减弱，而KLF6、TGFβ1等促纤维生成因子则明显增加，激活HSC导致肝纤维化形成。第二部分：PPARγ激动剂罗格列酮对大鼠NASH肝纤维化形成的影响目的：观察罗格列酮干预对NASH肝纤维化大鼠核转录因子KLF6信号通路的影响，探讨罗格列酮的抗炎、抗肝纤维化效果及机制。方法： 12只Wistar雄性大鼠高脂喂养8周后，给予4mg／kg／d罗格列酮干预(干预组，T组)，同时设立对照组(C组)和高脂模型组(F组)，24周末称重后处死所有大鼠，留取血清及肝脏进行血脂、肝功、肝纤维化标志物、肝组织病理学染色以及RT-PCR检测肝组织PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA和免疫组化检测PPARγ、KLF6和α-SMA的表达。结果：①HE和Masson染色显示模型组大鼠24周末均可见典型脂肪性纤维化，治疗组炎症、纤维化程度均明显减轻和改善，但与对照组相比其炎症、纤维化程度仍有差异(P0．01)；②血清学指标显示罗格列酮干预16周后可明显降低高脂饲料喂养诱导的TG、FFA、AST、ALT、HA、LN、CⅣ等的增高，两组间差异显著(P0．01)；③RT-PCR显示24周后模型组KLF6(0．96±0．08)、TGFβ1(0．91±0．07)和α-SMA(1．07±0．19)的相对表达量均明显上调，与对照组比较有显著的统计学差异(P0．01)；治疗组则显示增高的上述基因呈不同程度的下调，两组间差异显著(P0．01)。④免疫组化显示干预组KLF6、α-SMA的表达较模型组明显减少，，PPARγ的表达则明显增加，两组差异有统计学意义(P0．05)。结论： 1、罗格列酮可以激活PPARγ，下调NASH肝纤维化大鼠肝组织核转录因子KLF6及其下游靶基因TGFβ1的表达，抑制HSC的活化，阻止肝纤维化形成过程，这可能是其发挥抗肝纤维化的作用机制之一； 2、罗格列酮对高脂饮食诱导NASH肝纤维化大鼠具有一定的防治作用，可通过降低血脂，改善脂肪酸代谢紊乱，减轻炎症反应从而减轻肝纤维化程度。
【图文】：

罗格列酮,对照组,鼠肝组织

300bP150bp图2一l罗格列酮对人鼠肝组织 KLF6mRNA表达的影响:、2对照组，3、4高脂模型组，5、6罗格列酮组900bP600bP450bP300bPp一ad功 TGFpl452bP298bP150bP图2一2罗格列酮对大鼠肝红{织丁GF甲mRNA表达的影响:、2对照组，3、4高脂模型组，5、6罗格列酮织以一S拟5时bP IPPPp obDbobob门 CUU工匕nOJ匕月4巧」150bP900bP600bp450bP350bP150bPp一 actIn45乃p图2一3罗格列酮对大鼠肝织织a一SMAmRNA表达的影响:、2对照组，3、4高脂模型组，5、6罗格列酮组
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R575.2

【参考文献】