间充质干细胞移植治疗急慢性肝损伤的实验研究

发布时间：2020-05-19 15:38

【摘要】： 本实验分为体内、体外两部分。体外实验中首先采用组织块贴壁培养法分离、纯化、扩增和冻存人脐带MSCs,MTT法测定P7人脐带MSCs生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期及表面标志,透射电镜观察MSCs超微结构,并检测其在成骨、成脂肪细胞诱导液中的横向分化能力。而后将P7 MSCs培养在DMEM/F12+10%FBS+HGF 20ng/ml +bFGF10ng/ml+OSM 20ng/ml的诱导体系中,诱导后不同时间点采用免疫细胞化学检测AFP、ALB、CK18等肝系细胞的标志;并检测培养上清中AFP、ALB及尿素含量;采用PAS法检测诱导细胞是否出现糖原;并在电镜下观察细胞超微结构的变化。体内实验中首先从Wistar大鼠骨髓中分离、纯化、扩增MSCs,取P5对数生长期细胞用荧光染料Hochest33342标记后,分别经尾静脉、门静脉、肝内注射三种途径移植于CCl4造成的大鼠急性肝损伤模型体内;经门静脉、肝内注射途径移植于CCl4制造的大鼠慢性肝损伤模型体内。移植后不同时间取材,通过血清学、病理学检测移植效果,探讨MSCs移植后修复急、慢性肝损伤的可行性,以及何种途径移植更有效。结果显示70%以上人脐带MSCs处于G0/G1期,为正常二倍体细胞,强烈表达CD105、CD90、CD44,基本不表达CD34、CD31、CD45。具有处于原始状态下细胞超微结构的特点和自我更新能力,并可向成骨细胞和脂肪细胞分化,复苏后人脐带MSCs的形态及生长特性没有明显变化。而且,人脐带MSCs可在体外诱导分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞,联合应用HGF+bFGF+OSM比应用HGF+bFGF的诱导分化效率高。体内试验中,经门静脉、肝内注射途径移植MSCs,对急、慢性肝损伤具有修复作用,肝内注射途径优于门静脉途径。本研究的创新之处:通过组织块贴壁培养法,系统地建立了稳定的人脐带MSCs体外分离、纯化、扩增培养及冻存体系,为人脐带MSCs最终应用于临床奠定了基础,目前国内外均未见报道;确立了高效诱导人脐带MSCs体外向肝样细胞分化的诱导体系,可为肝细胞移植、生物人工肝、肝组织工程提供大量种子细胞,国内未见报道;通过检测不同途径移植的MSCs在急、慢性肝损伤模型中的定位、分化及功能表达,确立了有效的移植途径,从而探讨了新的治疗修复急、慢性肝损伤方法,目前国内未见系统报道。
【图文】：

原代培养,相差显微镜

27图3.1 原代培养hUCMSCs（倒置相差显微镜）A：5d（×100） B:7d（×40）Fig3.1 The hUCMSCs of primary culture（inverted phase contrast microscope）A: on 5th day（×100） B: on 7th day（×40）3.2 结果3.2.1 hUCMSCs的形态学观察组织块贴壁后5~6d可见大量细胞自组织块游出，于周边向外贴壁呈放射状生长（见图3.1A），，6~8d可见散在分布、贴壁生长的细胞集落（见图3.1B）。细胞多为双突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，折光度好，核仁明显。两周后，细胞形态变为均一的纺锤形，原代细胞培养需10~14d。此时细胞达到80%~90%左右的汇合程度，消化后，按1：2~1：3的比例传代，细胞接种于培养瓶后约30分钟，约有90%的细胞迅速贴壁

相差显微镜,传代培养

1期（见图3.5）。图3.2 传代培养3d的P3 hUCMSCs（倒置相差显微镜×40）Fig3.2 The hUCMSCs of P3 on 3th dayafter serial subcultivation图3.3 冻存复苏7d的hUCMSCs（倒置相差显微镜×40）Fig3.3 The cryopreserved hUCMSCson 7th day
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575

【参考文献】