HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白相互作用的初步研究

发布时间：2020-05-19 22:42

【摘要】： 目的:为进一步研究HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与宿主胰腺细胞的相互作用。方法:1.将酵母细胞表达载体pGBKT7-LHBs转化AH109酵母菌株,与含有胰腺细胞文库质粒的Y187酵母菌株进行配合,行酵母双杂交,筛选人胰腺中LHBs结合蛋白基因。2.应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR),扩增人胰腺CDK5RAP3基因。3.构建真核表达质粒pcDNA-3.1 -myc-his-CDK5RAP3,通过真核表达系统,应用免疫共沉淀技术及Western blotting方法证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内的相互作用关系。4.构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,通过真核表达系统,应用哺乳动物双杂交技术证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内的相互作用关系。5.构建CDK5RAP3的红色荧光表达载体pDsRed1-N1-CDK5RAP3,将其与绿色荧光表达载体pEGFP-LHBs分别转染Capan2细胞,模拟该蛋白在细胞中的表达,在激光共聚焦显微镜下观察LHBs及CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位。结果:1.成功筛选出人胰腺细胞中11种与LHBs存在相互作用的已知功能蛋白,其中包括羧肽酶B1、胰凝乳蛋白C、人类胰蛋白酶原2、线粒体蛋白基因、组织相容性复合体13、乌头酸酶1、蛋白酶2、辅脂肪酶以及核糖体蛋白L10a等已知功能蛋白。2.成功扩增人胰腺CDK5RAP3基因。3.成功构建CDK5RAP3基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-CDK5RAP3,同pcDNA3.1(-)LHBs行免疫共沉淀,证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系。4.成功构建CDK5RAP3基因的真核表达载体pACT-CDK5RAP3,同pBIND-LHBs等共转染Capan 2细胞,行哺乳动物双杂交,证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系。5.成功构建CDK5RAP3的红色荧光表达载体,并在Capan2细胞中得到表达。激光共聚焦显微镜观察到LHBs及CDK5RAP3蛋白均主要定位于细胞浆中。结论:本实验成功筛选人胰腺中LHBs结合蛋白基因,并且证实LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用,为下一步研究LHBs的作用机制奠定基础。
【图文】：

筛选配合产物在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-、38。计算可得Y187的成活性为2.93×106c105cfu/ml,配合效率为13.0%。性分析结果 挑选16个阳性克隆进行测序到11种已知蛋白基因（表2）。pGBKT7-LHBs质粒转化的酵母菌株AH109与胰库质粒的转化的酵母菌株Y187配合（箭头所示状二倍体细胞）

100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1521bpM 15444bp图 5 Capan2 细胞 mRNA 电泳图谱M DNA marker图6 CDK5RAP3基因PCR扩
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R512.62

【参考文献】

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1 张艳玲,张宏,梁秀彬,侯平,王海燕;应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白[J];北京大学学报(医学版);2003年04期

2 时德仁,东传凌,陆立,丛闻天,周燕;肝硬化时糖代谢紊乱与肝细胞胰岛素受体及胰腺细胞HBV DNA表达的关系[J];中华实验和临床病毒学杂志;2003年04期

3 范小玲!100011,徐道振!100011,李t，

本文编号：2671594