Apelin对酒精性肝病中炎症反应的作用研究

发布时间：2020-05-20 10:02

【摘要】：背景酒精肝(alcoholic liver disease,ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝,进而可发展为酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化,最终导致肝癌。酒精性肝病是一个全球性的公共卫生问题,每年全球约有上百万的ALD患者,具有很高的发病率及死亡率。Apelin作为一种重要的生物活性肽,是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,可以通过内分泌、旁分泌、自分泌的方式激活其受体APJ并与其结合,从而发挥病理学和生理学方面的作用。目前,有关apelin/APJ在肝脏疾病中的作用仍在探索中,apelin在酒精性肝病中的研究至今鲜有报道,最近有关文献表明在肝脏发生炎性损伤后,apelin的表达量明显增加,由此探索apelin在酒精性肝脏中的表达情况以及它与酒精性肝病发生发展的关系逐渐成为一个新的研究热点。目的本实验研究的目的是探讨在酒精性肝病中apelin与炎症因子之间的相互作用及影响;验证apelin是否促进酒精性肝病中炎症因子的表达,以及探索apelin促进肝脏炎症的机制。方法1.将RAW264.7细胞接种于培养板中,按实验分组分为酒精量效关系组:(1)对照组;(2)0.05μmol/L;(3)0.1μmol/L;(4)0.2μmol/L;处理时间为24 h;酒精时效关系组:(1)0 h;(2)6 h;(3)12 h;(4)24 h;处理浓度为0.1μmol/L,qRT-PCR检测apelin以及炎症因子转录水平的变化,通过油红染色观察细胞内脂质积聚情况。2.在RAW264.7细胞中加入不同浓度以及不同时间点的apelin-13处理24 h后,通过Western blot及qRT-PCR检测炎症因子水平的变化。3.在RAW264.7细胞中加入酒精(0.1μmol/L)孵育24 h后加入不同浓度以及不同时间点的apelin-13处理24 h,通过Western blot及qRT-PCR检测炎症因子水平的变化。4.将RAW264.7细胞分为空载组,空载(1.6μg)+酒精(0.1μmol/L)组,过表达apelin组(1.6μg),apelin+酒精(0.1μmol/L)组,转染24 h后按实验分组分别加酒精处理24 h后,通过Western blot及qRT-PCR检测炎症因子水平的变化,进行鬼笔环肽染色观察细胞微丝荧光表达的变化。5.将RAW264.7细胞分为si-con组,si-con+酒精(0.1μmol/L)组,si-apelin组,si-apelin+酒精(0.1μmol/L)组,转染24 h后按实验分组分别加酒精处理24 h后,通过Western blot及qRT-PCR检测炎症因子水平的变化,进行鬼笔环肽染色观察细胞微丝荧光表达的变化。6.构建酒精性肝病模型:选取6~8周C57BL/6雄性小鼠,19~23 g,适应性喂养一周后用于实验,将野生雄性小鼠随机分为3组:正常对照组;酒精处理组;apelin联合酒精组。喂养10周后处死,部分肝组织用4%中性甲醛溶液固定保存其余肝组织于液氮中速冻,再移至-80℃冰箱长期保存。7.提取小鼠肝脏蛋白,Western blot检测小鼠体内炎症因子的表达情况;免疫组织化学技术检测小鼠肝内炎症因子的表达情况;将小鼠肝脏组织经超声破碎匀浆后提取总RNA,qRT-PCR检测肝脏组织炎症相关因子转录水平的变化;酒精肝小鼠肝脏组织经过处理后做HE染色,从形态学方面观察小鼠肝脏损伤程度;通过油红染色观察小鼠肝组织内脂质积聚情况。结果1.在RAW264.7细胞中,给予不同浓度以及不同时间点的酒精刺激,qRT-PCR结果表明apelin、APJ以及炎症因子IL-6、IL-1β、趋化蛋白MCP-1基因的转录水平随酒精时间和剂量依赖性升高。2.油红染色检测RAW264.7细胞内脂质积聚随着酒精时间点以及浓度点梯度增加。3.在RAW264.7细胞中,单独加入不同浓度以及不同时间点的apelin-13处理后,apelin-13能浓度依赖及时间依赖性促进炎症因子IL-6,IL-1β以及趋化蛋白MCP-1,PCNA的蛋白水平及转录水平表达升高。4.在RAW264.7细胞中,先加入酒精孵育24 h后再给与不同浓度以及不同时间点的apelin-13刺激,造成炎症因子及趋化蛋白MCP-1,PCNA表达量的升高。5.在RAW264.7细胞中,Western blot及qRT-PCR结果显示,过表达apelin组与空载组相比,炎症因子IL-6、IL-1β以及趋化蛋白MCP-1,PCNA表达量均升高;apelin联合酒精(0.1μmol/L)组炎症因子IL-6、IL-1β以及趋化蛋白MCP-1,PCNA表达量上调最为明显。6.鬼笔环肽染色结果显示过表达apelin组及apelin联合酒精(0.1μmol/L)组较空载组及apelin组细胞内微丝荧光显色更强。7.在RAW264.7细胞中,通过Western blot及qRT-PCR结果表明敲低apelin组较正常组炎症因子IL-6、IL-1β以及趋化蛋白MCP-1,PCNA表达量明显降低。8.鬼笔环肽染色显示在RAW264.7细胞中敲低apelin会使细胞内微丝的荧光强度明显减弱。9.Apelin通过RAW264.7细胞中的ERK信号传导促进肝脏炎症的产生。10.动物实验中,经HE染色结果可知,酒精刺激可使肝细胞变性坏死,apelin与酒精联合处理组可见肝细胞广泛坏死,炎性细胞浸润明显。油红染色显示,酒精刺激会使肝细胞脂肪变性,apelin处理能够明显增加肝细胞内脂质积聚。11.免疫组化结果显示酒精组较正常组相比,apelin、MCP-1、PCNA的棕色颗粒明显增多,apelin与酒精联合处理组棕色颗粒最多,其结果与Western blot结果相一致。12.动物实验中,qRT-PCR结果显示apelin与酒精联合处理组相较于酒精组的炎症因子以及趋化蛋白MCP-1的转录水平表达量明显升高。13.动物实验中,Western blot结果显示酒精性肝病小鼠肝组织中apelin与酒精联合处理组相较于酒精组的MCP-1、PCNA、apelin蛋白的表达量明显升高。结论1.在RAW264.7细胞中Apelin通过激活ERK信号通路促进肝脏炎症的产生。2.在小鼠酒精性肝病模型中,apelin可以加重肝细胞脂肪变性,促进炎症的产生。
【图文】：

qRT-PCR 结果发现图 3-1-A 和图 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表达水平也随着酒精的时间点和浓度点递增，结果表明酒精可以促使炎症的产生和发展，同时还会使 apelin、APJ 基因表达增加，由此我们认为 apelin 与炎症的发生发展存在着一定的关联。

qRT-PCR 结果发现图 3-1-A 和图 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表达水平也随着酒精的时间点和浓度点递增，结果表明酒精可以促使炎症的产生和发展，同时还会使 apelin、APJ 基因表达增加，由此我们认为 apelin 与炎症的发生发展存在着一定的关联。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2672450