氨负荷下肝硬化大鼠模型水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表达与脑水肿关系的研究

发布时间：2020-05-21 12:55

【摘要】： 目的肝硬化及终末期肝病患者通常存在不同程度的脑水肿,血氨的升高促进了肝性脑病的发生。脑水肿使颅内压升高,二者的恶性循环使患者预后不佳。而目前,临床对其治疗非常有限。水通道蛋白(AQP)是膜水通道蛋白家族,为调节细胞水平衡的选择性孔道,其中AQP-4在大脑中分布广泛,它在脑内的研究成为近年来的研究热点,增加对其了解可能为临床脑水肿的治疗提供新的方案。本研究拟应用肝硬化动物模型,给予氨负荷,研究水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表达与脑水肿的关系。材料与方法实验动物为健康雄性(SD)大鼠,随机分为4组:(1)正常组:不加外界干预因素;(2)正常氨负荷组:实验末给予氨负荷;(3)肝硬化组:腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液制备肝硬化动物模型,注药时间为12周,实验末不加外界干预因素;(4)肝硬化氨负荷组:制备肝硬化模型,方法同肝硬化组,实验末给予氨负荷。 1、血氨的检测:各组大鼠在给予氨负荷前及氨负荷30分钟后分别经内眦静脉采血1ml,并在半小时内应用vitors AMON干片比色法测定血氨值。 2、血脑屏障通透性的检测:处死动物前2小时尾静脉注射伊文思蓝溶液,取脑组织溶于甲酰胺,离心取上清液于波长632nm进行比色,根据标准曲线计算出脑组织EB含量,以此评价BBB通透性的变化。 3、脑水含量的检测:处死大鼠后,完整取出脑组织,干湿重法检测脑水含量。 4、HE染色观察肝、脑组织切片:2小时后处死大鼠,立即取大脑及肝右叶组织,应用4%多聚甲醛固定。常规HE染色,显微镜下观察肝脏和脑组织情况。 5、RT-PCR方法检测AQP-4 mRNA表达:总RNA提取、逆转录反应、PCR扩增、PCR产物电泳。 6、免疫组化法检测脑组织AQP-4蛋白:取材、固定、组织块脱水透明、石蜡包埋、切片、染色、封片。 7、所有数据均以(?)±s表示,应用SPSS11.0软件进行方差分析,p值小于0.05认为差异有统计学意义。结果 1、肝硬化氨负荷组中5只大鼠角膜反射与翻转反射消失;正常组、正常氨负荷组及肝硬化组角膜反射与翻转反射存在。肝硬化组4只大鼠有腹水生成,肝硬化氨负荷组6只大鼠有腹水生成。显微镜下观察:肝硬化组及肝硬化氨负荷组大鼠肝小叶结构破坏,纤维组织增生,有明显硬化结节形成,而正常组及正常氨负荷组未见上述表现。四组大鼠脑组织大体标本未见异常。 2、血氨检测结果:给药前,肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠与正常组及正常氨负荷组大鼠相比,血氨水平明显升高,经检验P＜0.05;给药后,肝硬化氨负荷组血氨进一步升高,分别与其他三组相比,P＜0.05;肝硬化组血氨水平仍高于正常组及正常氨负荷组,经检验P＜0.05,有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。 3、血脑屏障通透性及脑水含量检测结果:肝硬化氨负荷组大鼠脑内EB含量分别与正常组、正常氨负荷组及肝硬化组相比显著增高,最高值达到1.9890 ug/g,经检验P＜0.05,有统计学差异;其他三组间经比较,P＞0.05,无统计学差异。肝硬化组及肝硬化氨负荷组大鼠脑内水含量分别与正常组、正常氨负荷组相比明显增高,P＜0.05,有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠脑内水含量与肝硬化组相比,P＜0.05,亦具有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。 4、AQP-4mRNA及蛋白表达检测结果:肝硬化及肝硬化氨负荷组可见清晰电泳条带,正常组及正常氨负荷组电泳条带模糊不清。肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠脑组织AQP-4mRNA积分光密度(ID)的表达显著高于正常组及正常氨负荷组,这两组分别与正常组及正常氨负荷组相比,P＜0.05,均有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠AQP-4mRNA积分光密度最高值达1.5100,高于肝硬化组,两组相比P＜0.05,有统计学差异。正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。四组大鼠脑组织免疫组化染色均可见AQP-4表达。肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠脑组织AQP-4较正常组及正常氨负荷组染色强度深,染色面积大。经灰度值测定后可发现:肝硬化及肝硬化氨负荷组灰度值明显低于正常组及正常氨负荷组,肝硬化及肝硬化氨负荷组与正常组及正常氨负荷组相比,P＜0.05,有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠灰度值低于肝硬化组,两组相比P＜0.05,亦有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。结论 1、腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液可制备肝硬化动物模型。 2、肝硬化动物模型存在氨代谢紊乱,给予高氨诱导后,血氨水平进一步升高,提示血氨可能在肝性脑病的发生中起重要作用。 3、肝硬化动物模型中,BBB通透性增加,脑水含量增加,AQP-4蛋白表达显著升高,在肝硬化氨负荷组动物模型中,三者表达同步升高,推测AQP-4可能参与了脑水肿发生发展过程。 4、肝硬化动物模型中,AQP-4mRNA及蛋白表达均升高,推测AQP-4mRNA可能是调节AQP-4蛋白表达的机制之一。
【图文】：

平均灰度,大鼠,情况

各组大鼠AQP一4平均灰度比较情况讨论肝性脑病是肝脏解毒功能不全和肝衰竭的重要表现，发病机制尚未完全阐明，目前存在的学说主要有:经典的氨中毒、假性神经递质、GABA、血浆氨基酸失衡学说等，，其中氨中毒学说仍占中心地位120]。血氨的升高对脑组织的损害表现在:干扰脑的能量代谢，使脑组织中的ATP生成减少，影响Na+一K+一ATP酶活性，破坏血脑屏障的完整性，干扰神经递质间的平衡，使脑内星形胶质细胞水肿。本研究通过腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液，制备肝硬化大鼠模型，给予高氨负荷，检测不同条件下大鼠氨负荷前后血氨水平。结果表明:给药前，肝硬化大鼠较正常大鼠血氨水平升高;给药后，正常大鼠血氨无明显变化，肝硬化大鼠血氨水平则明显升高，且出现角膜反射及翻转反射消失，提示肝硬化大鼠在未给氨之前，就已
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2

【参考文献】