SiRNA下调Smad3基因后对大鼠HSC及大鼠四氯化碳肝纤维化模型的纤维化相关影响
发布时间：2020-05-21 15:10
【摘要】：(1)肝星状细胞的激活是肝纤维化进程的关键步骤,而TGF-β/Smads信号途径对肝星状细胞的激活尤为重要,Smad3是介导TGF-β信号向细胞内传递、活化肝星状细胞的直接承担者,在肝纤维化发展进程中起着关键作用。本文以大鼠Smad3基因为研究对象,第一步构建并筛选出有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体。 (2)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体转染入大鼠星状细胞(hepatic setellate cells, HSC)HSC-T6中,下调表达Smad3基因,阻断TGF-β/Smads信号途径,通过体外试验观察对大鼠HSC的激活的影响,判断是否有抗纤维化。 (3)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体通过转染入大鼠四氯化碳肝纤维化模型中,探讨下调表达Smad3基因对大鼠四氯化碳肝纤维化模型中肝纤维化指标的影响,从而探索肝纤维化治疗的新方法。 (4)利用本实验室构建的ppGalNAc-T2的siRNA表达载体,观察ppGalNAc-T2下调后对大鼠肝星状细胞TGFβ1-Smad3激活途径相关基因表达的影响,从而初步探讨糖基转移酶ppGalNAc-T2对大鼠肝星状细胞的TGFβ1-Smad3信号激活影响。 方法 (1)利用互联网资源从基因库中获得Smad3基因序列,用ambion公司的siRNA设计工具,针对Smad3基因mRNA序列设计三条可能的小干扰RNA(siRNA),将这三条小干扰RNA插入到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中构建成三条干扰载体。将构建的3个带有荧光标记的Smad3干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分别转染大鼠肝星状细胞株(HSC)中,通过RT-PCR,Western-Blot的方法筛选出最有效的Smad3基因的siRNA表达载体。 (2)用脂质体2000转染试剂将最有效的Smad3 siRNA表达载体(pRNAT-siSmad3-2)转染入对数生长期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中,48小时后,用trizol提取总RNA,用RT-PCR检测下调Smad3以后对HSC的Smad2,3,4及胶原I,III,IV mRNA表达的影响。 (3)80只成年SD大鼠随机分成三组,对照组(30)模型组(30)治疗组(20),模型组和治疗组每周两次皮下注射40%(v/v)四氯化碳橄榄油(3 ml/kg),共8周。从第四周起用阳性脂质体将siRNA表达载体质粒(150μg/kg)在全麻,经皮下注入模型组大鼠肝右叶中,每两周一次,而模型组注入相同体积的缓冲剂。于第6、8周末,取得肝组织及血清,观察用纤维化半定量评分系统对病理切片的肝纤维化分级,及血清相关指标的影响。 (4)在大鼠肝星状细胞中转染ppGalNAc-T2的siRNA表达质粒,用RT-PCR检测TGFβ1- Smad3信号途径相关基因mRNA的表达变化,Western blot以及免疫荧光方法检测Smad3基因蛋白表达变化。 结果 (1)成功构建到三个Smad3基因的有效siRNA干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3),并筛选出pRNAT-siSmad3-2为相对最佳的载体。 (2)转染了pRNAT-siSmad3-2表达载体的肝星状细胞中Smad3和胶原I,III,IV mRNA表达都受到了明显抑制。 (3)治疗组较模型组,病理切片用纤维化半定量评分系统观察到肝纤维化分级有明显减轻(P 0.05),血清肝纤维化指标(III型前胶原,IV型胶原,层粘蛋白,透明质酸)亦有明显改善(P 0.01)。 (4)ppGalNAc-T2下调后肝星状细胞中Smad2,Smad3,Smad4,胶原3α1(collagen type III, alpha 1 ,Col3α1),转化生长因子β调节基因4(transforming growth factor beta regulated gene 4, Tbrg4 ),转化生长因子β1(transforming growthfactor beta, TGFβ1),转化生长因子β2(transforming growthfactor beta2, TGFβ2)及转化生长因子β受体3(transforming growth factor beta receptor3,Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表达几乎没有变化(P㧐0.05),但转化生长因子β受体1(transforming growth factor, beta receptor 1,Tgfβr1)和转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor2,Tgfβr2)都有较大程度的降低(P0.05) 结论 (1)转染pRNAT-siSmad3-2载体后,下调Smad3的表达,阻断TGF-β/Smad3信号途径,对大鼠HSC及四氯化碳肝纤维化模型有抗纤维化作用。 (2)RNAi下调Smad3的表达可以作为肝纤维化基因治疗的实验依据。 (3)在大鼠肝星状细胞中,ppGalNAc-T2下调对于TGFβ1-Smad3激活途径基因表达基本没有影响,其在肝星状细胞中的具体功能有待于进一步研究。
【图文】：
图 1-1 siRNA 表达载体 pRNAT-U6.1/Neo 结构图核苷酸的合成lenCircle RNAi Kit 说明合成正义链和反义链 oligo，序列aaac tgtaaaaa ATCCGCATGAGCTTCGTCAAA gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa TTTGACGAAGCTCATGCGGAT gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa TCTACCAGTTGACTCGCATGT gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa ACATGCGAGTCAACTGGTAGA gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa GTCAAAGGCTGGGGAGCCGAG gg tgt ttc gtc ctt tcaaac tgtaaaaa CTCGGCTCCCCAGCCTTTGACgg tgt ttc gtc ctt tcc RNA 模板的退火 oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正按如下配置退火反应体系：Components Volume (μl)
采用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行数据统计分析，正态分布资料用均数（x±s）标准差表示，统计学方法采用t检验，每个实验均重复三次。双侧检验P＜0.05时，差异有统计学意义。2 结果2.1 Smad3干扰表达载体的测序结果每个载体组挑选两个单克隆克隆进行测序鉴定（上海英骏生物技术有限公司），，测序结果正确。pRNAT-SiSmad3-2 的测序报告图（图 1-2）
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2
本文编号：2674488
【图文】：
图 1-1 siRNA 表达载体 pRNAT-U6.1/Neo 结构图核苷酸的合成lenCircle RNAi Kit 说明合成正义链和反义链 oligo，序列aaac tgtaaaaa ATCCGCATGAGCTTCGTCAAA gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa TTTGACGAAGCTCATGCGGAT gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa TCTACCAGTTGACTCGCATGT gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa ACATGCGAGTCAACTGGTAGA gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa GTCAAAGGCTGGGGAGCCGAG gg tgt ttc gtc ctt tcaaac tgtaaaaa CTCGGCTCCCCAGCCTTTGACgg tgt ttc gtc ctt tcc RNA 模板的退火 oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正按如下配置退火反应体系：Components Volume (μl)
采用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行数据统计分析，正态分布资料用均数（x±s）标准差表示，统计学方法采用t检验，每个实验均重复三次。双侧检验P＜0.05时，差异有统计学意义。2 结果2.1 Smad3干扰表达载体的测序结果每个载体组挑选两个单克隆克隆进行测序鉴定（上海英骏生物技术有限公司），，测序结果正确。pRNAT-SiSmad3-2 的测序报告图（图 1-2）
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2
【参考文献】
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8 ;Preparation and identification of anti-transforming growth factor β1 U1 small nuclear RNA chimeric ribozyme in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2003年03期
本文编号：2674488
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