HSF2在溃疡性结肠炎粘膜愈合中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-22 14:54

【摘要】：[目的]检测 HSF2(Heat Shock Factor 2,HSF2)在不同 MES(Mayo endoscopic subscore,MES)评分的溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)患者粪便及肠粘膜中的水平。明确HSF2能否量化成为UC患者粘膜愈合的一个预测指标;探索HSF2在UC粘膜修复过程中的作用机制;重组表达HSF2蛋白,验证活性。旨在为预测UC黏膜愈合提供新的粪便指标,阐明HSF2在粘膜愈合中的作用机制,为制备HSF2抗体和ELISA试剂盒奠定基础。[方法]本课题分为三个部分:第一部分:1.分别入组MES=0的患者12例,MES=1的患者15例,MES=2的患者14例,MES=3的患者10例,正常对照组10例,收集粪便及肠粘膜。ELISA检测粪便HSF2和粪钙卫蛋白(Fecal Calprotectin,FC)含量,免疫组化检查肠粘膜HSF2表达水平。进行Pearson相关性分析,分别比较粪便HSF2水平和MES评分,粘膜HSF2水平和MES评分,粪便HSF2和FC水平的相关性。2.纳入随访的UC患者231例,收集患者清晨粪便,次日进行肠镜检查并行MES评分。ELISA检测粪便HSF2和FC水平,以肠镜MES≤1为粘膜愈合评价标准,取HSF2 1.8 ng/ml为截断值,作为粘膜愈合的预测指标,采用诊断试验评价方法,计算粪便HSF2水平在预测粘膜愈合中的特异性与灵敏性,阳性预测值与阴性预测值,绘制ROC曲线,并且与FC对比,评价粪便HSF2水平预测UC粘膜愈合的临床价值。第二部分:1.甲泼尼龙治疗DSS(Dextran sulfate sodium salt,DSS)化学性结肠炎小鼠(1)雄性SPF级C57BL/6小鼠60只,随机分为正常对照组、DSS造模组、甲泼尼龙治疗组和安慰剂组,15只/组。DSS造模组、甲泼尼龙治疗组和安慰剂组自由饮用3%DSS溶液6天,治疗组于第7天起给予甲泼尼龙溶液灌胃,安慰剂组于第7天起给予甲泼尼龙等体积的HPMC(hydroxypropylmethylcellulose,HPMC)溶液灌胃,共干预6天,期间正常对照组和DSS组自由饮用去离子水,于第13天处死小鼠获取结肠标本。(2)评估DAI、结肠损伤评分及结肠黏膜组织病理学评分。(3)PCR和免疫组化检测各组结肠黏膜中HSF2及TGF-β的转录和表达水平。2.RNA干扰和质粒过表达干预HT-29细胞HSF2表达,LPS刺激细胞,ELISA检测细胞上清液IL-1β、TNF-α及TGG-β的含量,Western Blot检测ERK、P38、JNK及Smad2/3的表达及磷酸化水平。第三部分:1.构建pMAL-c2X-HSF2原核表达质粒,鉴定正确后,采用IPTG诱导HSF-MBP融合蛋白表达,直链淀粉柱纯化重组蛋白,FactorXa因子切割去除MBP标签后考马斯亮蓝染色及Western Blot鉴定重组表达蛋白。2.凝胶电泳迁移实验鉴定HSF2重组蛋白与热休克转录元件HSE结合,将重组蛋白与HT-29细胞共培养,PCR检测HSF2转录因子下游HSP70 mRNA转录水平,验证重组蛋白生物活性。[结果]第一部分:1.粪便HSF2在正常对照组及MES=0,1,2,3的UC患者粪便中的含量分别为(0.64±0.09,1.30±0.35,1.84±0.46,2.38±0.57,3.38±0.42)ng/ml。FC 在正常对照组及MES=0,1,2,3的UC患者粪便中的含量分别为(31.90±11.89,181±113.31,490.53±171.12,916.85±371.77,1320.20±286.09)ug/g。与正常对照组相比,粪便HSF2和FC含量在MES=0,1,2,3的UC患者组中均有升高。上述结果组间差异均有统计学意义(P0.01)。2.粪便HSF2和FC水平与MES评分均呈正相关,相关系数分别为(r=0.81,r=0.85)。粪便HSF2含量和FC含量也成正相关,相关系数r=0.91。说明粪便HSF2水平具有量化为粘膜愈合预测指标的潜质。3.UC患者结肠粘膜免疫组化染色显示HSF2表达于隐窝腺体细胞及间质细胞,在MES=0,1,2,3的UC患者肠粘膜内HSF2阳性细胞比例分别为(25.35±5.20,41.83±13.54,54.21±16.54,66.98±16.96)%,随着 MES 评分升高 HSF2 表达量增高,组间差异有统计学差异(P0.01)。肠粘膜HSF2表达水平与MES评分呈正相关,相关系数为r=0.74。4.以MES≤1为粘膜愈合的评价标准,取HSF2 1.8 ng/ml,FC 181 ug/g为截断值,作为预测粘膜愈合的指标,灵敏度分别为(67.8%,75%),特异度(80.9%,91.2%),阳性预测值为(67.1%,82.9%),阴性预测值为(81.5%,92.4%),粪便HSF2水平预测粘膜愈合的特异度和阴性预测值的临床价值优于敏感度和阳性预测值。5.粪便HSF2含量预测粘膜愈合曲线下面积AUC=0.919(95%[CI]:0.846-0.992,P0.0001),FC 含量预测粘膜愈合曲线下面积 AUC=0.958(95%[CI]:0.910-1.00,P0.0001),二者AUC均大于0.9,说明粪便HSF2水平预测粘膜愈合诊断试验具有较高的准确性。第二部分:1.DSS造模后甲泼尼龙治疗实验,与正常对照组相比较,DSS造模组、甲泼尼龙治疗组和安慰剂组的DAI、结肠损伤及组织病理评分明显增加,其中治疗组评分低于造模组与安慰剂组;小鼠肠粘膜PCR及免疫组化的结果显示DSS造模后结肠黏膜HSF2与TGF-β转录和表达水平同步升高,甲泼尼龙治疗后转录水平同步下降。2.与Negative Control对比,HSF2 siRNA干扰能显著降低HT-29细胞HSF2表达水平,ERK、P38及JNK蛋白磷酸化水平增高,LPS诱导HT-29细胞中上清液中IL-1β及TNF-α水平增高。相反的,与Blank Vetor对比,转染HSF2-FLAG质粒能明显提高HT-29细胞HSF2表达水平,ERK、P38及JNK蛋白磷酸化水平降低,LPS诱导HT-29细胞中上清液中IL-1β及TNF-α水平降低。3.与Negative Control对比,HSF2 siRNA干扰能显著降低HT-29细胞HSF2表达水平,降低Smad2/3磷酸化水平,降低TGF-β水平。相反的,与B1aank Vetor对比,转染HSF2-FLAG质粒能明显提高HT-29细胞HSF2表达水平,提高Smad2/3磷酸化水平,增加TGF-β水平。第三部分:1.成功构建pMAL-c2X-HSF2原核表达质粒,IPTG诱导后能大量表达可溶性HSF2重组蛋白,分离、纯化及去除MBP标签后考马斯亮蓝染色及Western Blot鉴定重组蛋白分子量大小正确。2.EMSA实验证实HSF2重组蛋白能与HSE结合,重组蛋白与HT-29细胞共培养后,能增加HT-29细胞HSP70 mRNA转录水平,说明HSF2重组蛋白具有生物活性。[结论]1.粪便HSF2含量能作为预测UC粘膜愈合的一个潜在评价指标,具有较高的准确性,其特异度和阴性预测值的临床价值高于敏感度和阳性预测值。2.DSS诱导小鼠化学性结肠炎及治疗后,肠粘膜HSF2与TGF-β转录水平同步升高和下降,提示HSF2可能调控TGF-β的表达,促进粘膜修复。3.HSF2通过抑制ERK、P38及JNK的磷酸化水平,减低LPS诱导HT-29细胞炎性因子IL-1 β及TNF-α的水平;HSF2通过促进Smad2/3磷酸化水平,提高HT-29细胞TGF-β的水平。提示HSF2能抑制炎症反应并促进粘膜修复因子表达,起到促进粘膜修复的作用。4.成功重组表达、分离纯化了具有生物活性的人源HSF2蛋白,为制备HSF2多克隆抗体和ELISA试剂盒,大规模检测粪便HSF2水平奠定了良好的基础。
【图文】：

肠粘膜,免疫组化检测,患者

逡逑性分析。免疫组化染色显示，ＨＳＦ２表达于隐窝腺体细胞及间质细胞（图２），随逡逑着ＭＥＳ评分升尚表达量增尚（表５），，而且各组间有明显统计学差异，Ｐ＜０．０１逡逑（图３：邋Ａ）。肠粘膜ＨＳＦ２与ＭＥＳ评分呈正相关，相关系数为ｒ＝０．７４（图３：邋Ｂ）。逡逑表５．肠粘膜ＨＳＦ２免疫组化阳性细胞数逡逑ＭＥＳ＝０逦ＭＥＳ＝１逦ＭＥＳ＝２逦ＭＥＳ＝３逡逑ＨＳＦ２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ逦２５．３５逦４１．８３逦５４．２１逦６６．９８逡逑Ｃｅｌｌ邋（％）逦±５．２０逦±１３．５４逦±１６．５４逦±１６．９６逡逑＿ｉ逋A逡逑ｃｍｉ逡逑ｍｍ逡逑图２．免疫组化检测ＵＣ患者肠粘膜ＨＳＦ２表达。Ａ：邋ＭＥＳ＝０患者；Ｂ：邋ＭＥＳ＝１逡逑患者；Ｃ邋：邋ＭＥＳ＝２患者；Ｄ邋：邋ＭＥＳ＝３患者。逡逑２４逡逑

统计图,肠粘膜,患者,免疫组化

免疫组化染色显示，ＨＳＦ２表达于隐窝腺体细胞及间质细胞（图２），随逡逑着ＭＥＳ评分升尚表达量增尚（表５），而且各组间有明显统计学差异，Ｐ＜０．０１逡逑（图３：邋Ａ）。肠粘膜ＨＳＦ２与ＭＥＳ评分呈正相关，相关系数为ｒ＝０．７４（图３：邋Ｂ）。逡逑表５．肠粘膜ＨＳＦ２免疫组化阳性细胞数逡逑ＭＥＳ＝０逦ＭＥＳ＝１逦ＭＥＳ＝２逦ＭＥＳ＝３逡逑ＨＳＦ２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ逦２５．３５逦４１．８３逦５４．２１逦６６．９８逡逑Ｃｅｌｌ邋（％）逦±５．２０逦±１３．５４逦±１６．５４逦±１６．９６逡逑＿ｉ逋A逡逑ｃｍｉ逡逑ｍｍ逡逑图２．免疫组化检测ＵＣ患者肠粘膜ＨＳＦ２表达。Ａ：邋ＭＥＳ＝０患者；Ｂ：邋ＭＥＳ＝１逡逑患者；Ｃ邋：邋ＭＥＳ＝２患者；Ｄ邋：邋ＭＥＳ＝３患者。逡逑２４逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62

【参考文献】