NASH小鼠肠粘膜屏障损伤与肠粘膜菌群失调的相关性研究

发布时间：2020-05-24 21:49

【摘要】：目的1.通过高脂饮食(HFD)和蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)建立非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)小鼠模型,通过 16s rRNA基因测序检测两种NASH模型小鼠肠粘膜菌群的改变。2.检测评估两种模型小鼠肠粘膜屏障的损伤并分析与肠粘膜菌群紊乱之间的相关性。方法1.构建小鼠NASH模型:分别通过HFD和MCD建立小鼠NASH模型。处死小鼠后留取相应标本。2.应用苏木精-伊红(Hematoxylinand eosin,HE)染色和油红(Oil red)O染色观察肝组织病理学的改变。3.检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)、D-乳酸及细菌内毒素浓度。4.应用HE染色观察结肠粘膜病理学改变。应用免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)观察紧密连接蛋白occludin的表达与分布。5.采用流式细胞术检测结肠巨噬细胞(macrophage,M(?))及髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的数量变化情况。6.应用16s rRNA基因测序检测并分析各组小鼠结肠粘膜菌群的变化情况。结果1.成功构建两种小鼠NASH模型:与ND组相比,HFD组的体重、肝重、肝指数、ALT及AST均增加(P0.05);同样,MCD组的ALT及AST也比CON组明显升高(P0.05)。肝脏HE染色及油红O染色显示对照组肝组织着色均匀,肝细胞结构完整,未见脂滴以及炎性细胞浸润,而HFD组和MCD组的肝脏都出现明显的肝细胞脂肪变性与炎症反应。上述结果显示两种小鼠NASH模型成功建立。2.NASH小鼠肠粘膜屏障功能损伤:与对照组相比,HFD组和MCD组的结肠组织绒毛排列疏松紊乱,部分绒毛出现萎缩、缺损、断裂,甚至出现上皮层与固有层分离。模型组occludin蛋白较对照组表达降低,分布异常。进一步流式细胞术检测结果表明,模型组的肠粘膜中M(?)与MDSCs数量均较对照组明显增多(P0.001)。同时,HFD组和MCD组的DAO、D-乳酸及细菌内毒素也均较对照组明显升高(P0.05)。3.肠粘膜菌群紊乱:在菌群门水平,HFD组较ND组变形菌门增多(P=0.08),放线菌门和疣微菌门减少(P0.05)。MCD组较CON组增多的菌群有脱铁杆菌门(P0.05),减少的菌群有拟杆菌门及疣微菌门(P0.05)。HFD组和MCD组共同减少的菌群是疣微菌门。根据两种模型共同增加或减少的菌群,我们发现Akkermansia菌属在两种模型中都是明显减少的(P0.05),该菌属于疣微菌门。4.肠粘膜屏障指标与Akkermansia菌属丰度相关性分析:HFD组的DAO(r=-0.879,P0.05)、D-乳酸(r=-0.898,P0.05)及细菌内毒素(r=-0.936,P0.05)分别与Akkermansia丰度呈负相关。同样的,MCD组的DAO(r=-0.957,P0.05)、D-乳酸(r=-0.891,P0.05)及细菌内毒素(r=-0.880,P0.05)也分别与Akkermansia的丰度呈现负相关。结论1.两种模型均可见到机械屏障受损,肠粘膜损伤,肠绒毛变短、稀疏,紧密连接蛋白occludin表达下降,通透性增加,内毒素移位,肠粘膜免疫屏障功能被激活,出现M(?)和MDSCs数量增多。肠粘膜屏障损伤可能是NASH发生发展的重要原因。2.两种模型都出现肠粘膜菌群失调,Akkermansia丰度在两种模型中都是减少的,另外在两种模型中Akkermansia丰度分别与DAO、D-乳酸及细菌内毒素呈负相关,说明该菌的减少可能会加重肠粘膜屏障的损伤。
【图文】：

体重增长平缓。ＨＦＤ组小鼠体重增长更快，８周后毛发变得紊乱无光泽，逡逑精神变差，活动量减少。１２周后处死时的体重（３４．６邋土邋０．７）较ＮＤ组（３１．１６邋±邋０．８５）逡逑明显增加（Ｐ＜０．０１，图１Ｂ）。ＭＣＤ组小鼠的体重在２周内快速下降，２周后局逡逑部出现毛发脱落，易怒，喜争斗。３０天后处死时的体重（１５．２９±邋０．３６）较ＣＯＮ逡逑组（２５．６１±０．８９）明显减少（ＰＣ０．００１，图邋ＩＤ）。逡逑Ａ邋ｎｏ逦Ｂ邋４0－｜逦＇逡逑４０＾邋X4＊邋ＨＦ０逦—｜—逡逑芸邋３５＿逦ｆ逦丨逡逑２0ｆ－ｉ邋－ｒ邋ｒ－ｉ邋？邋ｉ邋ｉ邋？邋ｉ邋？邋ｉ邋）逦９ＨＢ逡逑０１２３４５６７８９邋１０ｔ１１２逦＾逦逦＇逦逦邋１逦逦逡逑Ｗｏ？ｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＨＦＤ逦令逦々逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑？ＣＯＮ逦■￣￣—￣￣．逡逑＋邋ＭＣＤ逦丁逡逑ｉ：ｎ＿逡逑０逦３逦？逦？邋ｔ２邋ｔｓ逦１｜邋２１邋２４邋２；邋Ｍ逦＾逦Ｏ逡逑Ｄａｙｓ邋ＭＣＤ逦ｃＰ逡逑图１各组小鼠体重的变化（＊＊Ｐ＜0．0ｌ，邋＊＊＊Ｐ＜0．00ｌ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋（＊＊Ｐ＜０．０１？邋＊＊＊Ｐ＜邋０．００１）逡逑２小鼠的肝脏形态、肝重、肝指数比较逡逑ＮＤ组和ＣＯＮ组的肝脏颜色红润，形态饱满，边缘锐利。ＨＦＤ组小鼠肝脏逡逑肿大，颜色变黄，表面可见结节。ＭＣＤ组小鼠肝脏萎缩，颜色变黄，表面出现逡逑大量结节。（图２Ａ－Ｂ）逡逑ＮＤ组和ＨＦＤ组的肝重分别是１．４５±０．０６和丨．８７±０．１０

逡逑加，差异有统计学意义（ｐ＜０．０１，图２Ｃ），，ＨＦＤ组的肝指数（５．３９±０．２２）也较逡逑ＮＤ邋组（４．６５±０．０９）明显升高（Ｐ＜０．０１，图邋２Ｅ）。ＭＣＤ邋组的肝重（０．７６±０．０３）逡逑较（：０＞１组的肝重（１．６２土０．０５）明显下降，差异有统计学意义（？＜０．００１，图２０），逡逑同时ＭＣＤ组的肝指数（４．９４±０．１３）也较ＣＯＮ组（６．３７±０．２１）明显下降（ＰＣ０．００１，逡逑图邋２Ｆ）。逡逑＾邋ＷＷ邋＾邋蠢秦？邋＿逡逑？．彟ｉ＇：邋％、二．邋ＭＣＤ逡逑ｒｔ邋＂Ｔ邋—逡逑了…＂…ＩＨ邋＊＊，．邋Ｍ逡逑＜邋’逦．一邋‘：：、久．：．．．通磁么l拀逡逑ＣＤ＊＊＊逡逑２邋ＣＨ｜逦ｉ逦，逡逑§２．５－，逦＊＊邋？逦ｊｉ－邋ｐｎ逡逑ｆ邋ｉ；ｓ邋ｌ—１邋ｍ邋ｉ－邋＿逡逑１４邋■逦＿逡逑Ｅ逦Ｆ逡逑＊！邋…逡逑ｉｒｋ逡逑Ｓ５邋６１逦１逦ｏ６＂逦＇逡逑ｉ－ｎ邋■逦＿逡逑」Ｏ＇＊４－１邋￣ｉ—￣３ｌ邋１邋■邋｜邋Ｕ｜Ｕ逡逑图２各组小鼠肝脏形态、肝重及肝指数的变化情况（＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2679042