PSTPIP2的甲基化修饰调控肝脏巨噬细胞极化过程对四氯化碳诱导的肝纤维化和炎症的作用研究

发布时间：2020-05-25 01:47

【摘要】：肝脏巨噬细胞在肝脏纤维化发生发展的过程中具有重要的调节作用。目前,表观遗传修饰机制越来越被认为是调控巨噬细胞表型的关键因素,其在巨噬细胞DNA水平的调控作用引起了研究者们广泛的关注。然而,有关肝纤维化中巨噬细胞DNA甲基化修饰参与其表型变化调控的具体机制尚不明确。本研究利用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)腹腔注射诱导四周构建小鼠肝纤维化模型,后通过肝脏原位灌流的方法提取小鼠原代肝脏巨噬细胞,采用流式细胞分选的方法分离出肝脏巨噬细胞,利用简化的亚硫酸氢盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)分别对对照组小鼠和肝纤维化模型组小鼠肝脏巨噬细胞DNA进行甲基化水平的分析。RRBS测序结果表明,相比于对照组小鼠巨噬细胞DNA,纤维化模型组小鼠巨噬细胞DNA甲基化水平显著升高,并且本研究筛选出26个基因,其启动子区域存在多个CPG岛。其中,在18号染色体上,77,843,840~77843968区段的5’-untranslated region(5’-UTR)区,脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸磷酸酶相互作用蛋白2(Proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 2,PSTPIP2)高甲基化水平引起了我们的关注。为了鉴定对照组小鼠和肝纤维化小鼠中PSTPIP2的蛋白及mRNA的表达情况,通过Western blot和q-PCR分析,结果发现模型组小鼠中PSTPIP2的蛋白及mRNA的表达水平明显低于对照组小鼠。并且肝组织免疫荧光结果显示模型组小鼠巨噬细胞中PSTPIP2的荧光亮度明显减弱。为了探究PSTPIP2表达变化对肝纤维化小鼠的影响,本研究通过构建重组腺相关病毒(Recombination Adeno-Associated Virus,rAAV)作为载体将PSTPIP2在肝脏进行过表达,后再进行CCL4诱导四周。通过Western blot分析,α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)及一型胶原(Type I collagen,COL1a)的蛋白表达相对于空病毒载体纤维化小鼠显著减少,结果提示小鼠肝脏纤维化程度明显减轻。此外,通过ELISA检测小鼠血清中的促炎因子,其中包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素12(interleukin-12,IL-12)和单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1);以及抗炎因子,其中包括白介素10(interleukin-10,IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)及白介素13(interleukin-13,IL-13),结果表明在小鼠肝脏过表达PSTPIP2显著降低促炎因子的表达,及提高抗炎因子的表达,尤其是IL-10的表达。以上结果均提示,PSTPIP2在小鼠肝纤维化发生发展及炎症中起到非常重要的作用。机制上,本实验通过脂多糖(LPS)及干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)共同诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞株建立M1型巨噬细胞以及利用白介素4(interleukin-4,IL-4)诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞株建立M2型巨噬细胞,通过Western blot和q-PCR分析,结果发现PSTPIP2的DNA甲基化与甲基化转移酶3a(DNA methyltransferase 3a,DNMT3a)及甲基化转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)有关,并且PSTPIP2通过互相结合作用抑制STAT1的磷酸化以及促进STAT6的磷酸化来参与调节巨噬细胞表型的变化。以上研究表明,PSTPIP2的甲基化可能加重肝纤维化,且其将肝脏巨噬细胞的甲基化和极化(表型变化)联系在一起,并可能成为调控肝损伤和炎症的一个平衡点,从而调控肝纤维化的发生发展。
【图文】：

安徽医科大学博士学位论文结果 CCL4 诱导肝纤维化小鼠模型的建立及鉴定本研究建立肝纤维化小鼠模型（10%CCL4 腹腔注射，0.001ml/g 注射剂量，注射两次，共注射四周）。为了鉴定小鼠肝纤维化程度，应用 HE 以及 Masson法，结果发现模型组小鼠存在明显的肝细胞结构破坏,血管周围有大量的炎胞浸润以及存在显著胶原沉积的表现。应用免疫组织化学法对小鼠肝脏组织，结果发现模型组小鼠组织中 α-SMA 呈高表达，主要表达于细胞间质中，黄色(图 1)。

维化小鼠及对照组小鼠肝组织中 α-SMA 和 COL1a 蛋白 Total α-SMAand COL1a protein levels in liver tissue were. The results are shown as relative expression against controeatment. (n=6 in vehicle group, n=6 in CCL4-induced group##P<0.01 vs vehicle mice.用微板法对两组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨，结果发现模型组小鼠中 ALT,AST 表达水平明显高于
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2679354