IL-17A诱导PBC肝内胆管上皮细胞EMT及其机制探讨

发布时间：2020-05-26 00:37

【摘要】：一、研究背景及目的原发性胆汁性胆管炎(PBC)最终结局是肝硬化,典型病理学改变是肝内小胆管慢性非化脓性破坏性胆管炎及胆汁性肝硬化,肝内胆管上皮细胞(IBEC)损害明显。上皮-间质转化(EMT)与肝纤维化的发生发展密切相关,通过抑制EMT可延缓或阻断肝纤维化进程。体内EMT受多因素影响,IL-17A在EMT中作用近年倍受重视。因组织器官和疾病的差异,IL-17A在细胞EMT及器官纤维化中的研究结论不一。当前研究尚未明确IL-17A诱导IBEC-EMT及其分子机制,以及该病理过程在PBC发病中的价值。本研究结合临床病理及免疫组化研究了 PBC发展过程中IBEC-EMT发生情况以及IL-17A表达变化,并探索相关胞内信号途径以阐明IL-17A诱导IBEC-EMT的分子机制,初步阐明IL-17A诱导IBEC-EMT在PBC发病机制中的意义。二、研究内容1、通过PBC病例临床、病理分析及肝脏组织免疫组化,检测PBC患者是否发生IBEC-EMT,肝内胆管中IL-17A表达变化以及外周血IL-17A等炎性细胞因子的变化,评价以上指标与PBC发病的相关性。2、通过IBEC的体外培养,观察IL-17A诱导IBEC-EMT,并探索其可能的分子机制。2.1建立EMT经典细胞模型:分别用不同浓度TGFβ1干扰培养IBEC,在不同时间检测EMT相关标志物mRNA及蛋白表达水平的改变,主要为验证IBEC可以诱导出EMT,为下一步实验给予细胞、试剂、条件、方法等方面做准备。2.2观察IL-17A是否可诱导出IBEC-EMT:在不同时间应用不同浓度IL-17A干扰培养IBEC,观察细胞形态变化及检测EMIT相关标志物mRNA及蛋白表达水平,证实IL-17A可诱导出IBEC-EMT,并探索其最佳时间和浓度,为后续分子机制探索奠定基础。2.3应用siRNA沉默IBEC相应靶基因,检测IL-17A干扰培养IBEC可能信号通路上相关mRNA及蛋白表达变化情况,探索IL-17A诱导IBEC-EMT分子机制。3、IL-17A和 TGF-β1 共同干扰培养 IBEC,观察 IL-17A对 TGF-β1 诱导 IBEC-EMT的影响。三、研究方法1、ELISA检测以下血清中的生物标志物及细胞因子:血清IL-17A、AMA-M2、IL-6、IL-8、IL-23、MIP3a/CCL20、TGFβ1 的检测。2、速率散射比浊法检测以下特定蛋白:血清IgG、IgA、IgM、C3、C4、ASO、RHF、CRP、轻链κ、轻链λ、游离KAP、游离LAM。3、HE染色直接观察肝脏的病理情况及病理分期。4、免疫组组织化学实验检测IBEC-EMT标志物及相关指标,包括CK7、CK19、Vimentin、E-cadherin、IL17A、IL17AR。5、IL-17A诱导IBEC-EMT及其分子机制,主要应用技术包括:细胞培养技术、流式细胞术、Quantitative real-time RT-PCR、Western blotting、siRNA 干扰等。四、研究结果1、PBC患者反映胆汁淤积TBIL、DBIL、GGT、ALP等多项生理生化指标均存在明显异常,血清IL-6、IL-8、MIP-3a、TGFβ1、IL-17A等多种相关炎性细胞因子水平明显升高。2、HE染色分析9例不同分期的(Ⅰ期3例、Ⅱ期4例、Ⅲ期2例)的PBC病例以及4例正常人肝组织的病理学改变,结果显示:PBC患者肝内胆管上皮细胞上皮标志物E-cadherin明显降低,间质标志物Vimentin明显增高,同时IL-17A、IL-17RA表达升高,提示在PBC发展过程中伴随IBEC-EMT的发生,且此过程可能与IL-17A介导的信号通路有关。3、TGFβ1诱导IBEC-EMT最佳浓度为5ng/ml,最佳时间为48h。4、IL-17A可诱导IBEC-EMT,最佳浓度为50ng/ml,最佳时间为48h。5、IL-17A干扰培养IBEC,转染siRNA-Act1可阻断IBEC-EMT过程,同时下游信号通路上Act1、P65/p-P65、p-IκB等多种信号蛋白表达异常。6、IL-17A和TGF-β1共同干扰培养诱导IBEC-EMT较单独应用明显。五、研究结论1、PBC患者多项生理生化指标异常,外周血清IL-17A等多种炎性细胞因子水平升高,可能与PBC的发病机制相关。2、PBC患者存在IBEC-EMT及肝内胆管上皮细胞IL-17A、IL-17RA高表达,IL-17A可能参与PBC肝内胆管IBEC-EMT。3、IL-17A 诱导 IBEC-EMT 可能是通过 IL-17A-IL-17RA-Act1-NF-κB 信号通路发挥作用。4、IL-17A与TGF-β1对IBEC-EMT过程起协同作用。
【图文】：

细胞因子,肝细胞,肝组织,免疫组化

１．４．２邋ＨＥ染色分期及胆管标志物ＣＫ７、ＣＫ１９免疫组化结果逡逑ＨＥ染色分析９例ＰＢＣ组织病理学分期：Ｉ期３例、ＩＩ期４例、ＩＩＩ期２例；逡逑４例正常肝组织。如图１－２所示图Ｂ、Ｄ、Ｆ示ＰＢＣ患者镜下肝组织小叶结构完逡逑整，肝细胞形态规则，部分肝细胞水肿，部分肝细胞羽毛样变性，肝细胞点逡逑状、灶状坏死，局灶融合坏死，肝ＩＩ区可见少许胆栓形成，中央静脉扩张，周逡逑边肝细胞坏死，纤维组织增生；汇管区可见６个，周边胆管增生，间质内混合逡逑性炎细胞浸润，局部轻度界面炎，汇管区扩大，并呈星芒状延伸，局部呈弓状逡逑包绕肝组织，ＣＫ７、ＣＫ１９免疫组化示胆管增生，该病例形态符合ＰＢＣ病理分逡逑期ＩＩ期；图Ａ、Ｃ、Ｅ是ＨＣ对照组镜下肝小叶结构正常，肝细胞未见脂肪变逡逑性

转染,信号通路,红色荧光,荧光显微镜

逦４８ｈ逦ＩＬ－１７Ａ邋５０ｎｇ／ｍｌ逡逑图２－３邋ＩＬ－１７Ａ干扰培养ＩＢＥＣ凋亡实验逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－３邋Ｔｈｅ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＩＢＥＣ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｗｉｔｈ邋ＩＬ－１７Ａ逡逑２．４．５邋ＩＬ－１７Ａ邋诱导邋ＩＢＥＣ－ＥＭＴ邋信号通路逡逑ＩＬ－１７Ａ诱导ＩＢＥＣ－ＥＭＴ可能主要通过以下信号通路发挥作用：ＩＬ－１７Ａ—逡逑ＩＬ－１７ＲＡ—Ａｃｔｌ—ＮＦ－ＫＢ，，在邋ＩＬ－１７Ａ邋诱导的情况下，用邋ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ邋沉默邋ＩＢＥＣ逡逑相应蛋白的表达，检测相关ｍＲＮＡ及蛋白衣达情况。逡逑２．４．５．１邋瞬时转染邋ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ邋ＩＢＥＣ邋６ｈ邋结果逡逑图２－４可见，ｃｙ３标记的转染对照ｓｉＲＮＡ，无化学修饰，与实验中的靶基逡逑因ｓｉＲＮＡ－Ａｃｔｌ共同转染ＩＢＥＣ邋６小时，在倒置相差荧光显微镜下可观察到几乎逡逑所有细胞膜上有较强红色荧光出现
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.7

【参考文献】