乙型肝炎病毒X基因多态性及X蛋白结合蛋白的初步研究

发布时间：2020-05-27 11:26

【摘要】： 目的:分子流行病学方法检测乙型肝炎病毒(HBV)病毒株X基因一种新的变异方式。利用酵母双杂交技术自健康人肝细胞cDNA文库中筛选HBV X蛋白结合蛋白基因,并以反向酵母双杂交方法验证候选结合蛋白。通过病毒蛋白-宿主蛋白作用探讨X蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。 方法:自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,扩增X基因序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异位点以及变异形式。选择克隆X基因序列作为研究靶基因,定向克隆到pDEST32构建表达X基因诱饵质粒,命名为pDEST32—X,western blot法验证pDEST32—X的表达。酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,选择阳性克隆质粒DNA测序,进行生物信息学技术分析。根据正向酵母双杂交的结果,PCR法扩增TCP1基因构建成诱饵质粒,将X基因构建成猎物质粒,反向酵母双杂交法验证正向筛选候选结合蛋白。 结果:自21例患者中共挑选74个克隆测序,测序结果提示54个克隆X基因下游大段缺失突变,长度达234nt,位于1601-1834nt处,另有1个克隆发生245nt缺失突变。成功克隆了HBV X基因,构建了pDEST32-X酵母表达质粒及pDEST22-肝细胞cDNA文库。酵母双杂交筛选获得18个阳性克隆,其中3个克隆测序成功,均为TCP1蛋白基因。反向双杂交进一步验证了TCP1与HBV X蛋白的相互作用。 结论:观察到一种X蛋白变异方式,这种大段缺失突变导致X蛋白下游编码序列丢失。成功筛选并克隆出肝细胞中HBV X蛋白相互作用蛋白——TCP1蛋白基因,有利于进一步研究HBV X蛋白在肝癌发生发展中的作用机制。
【图文】：

产物长度存在两种形式，约 700bp和约 500bp两种。不同患者来源病毒PCR产物电泳后展示为3种形式:单独700bP(3例)、单独 500bp条带(7例)和两条不同长度条带同时存在(11例，图1)。长度约500bP的PcR产物提示在靶基因内部具有缺失突变，其范围大约200饰左右。 X475X486X284X395X441X482X489M公址r如加的姗溯枷柳100图1靶基因PCR产物9留L琼脂糖凝胶电脉图 2.3DNA测序结果:经PCR法获得的靶基因经回收后连接入 pMD19T载体，21例患者共克隆出421个克隆。考虑到HBV是以准种形式存在，每例患者的克隆群中至少选择2个阳性克隆进行测序，共选择74个克隆进行DNA测序。测序结果存储于GenBank中:EUO43336一EU043352。经过比较，本研究观察到的缺失突变株中有54株表现为 nt1601一1834处发生大段缺失突变，长度234nt(图2)，涵盖了X基因1372一1836nt处的中下游部分

活HIS、Ura、LaeZ三个报告基因表达、而Pn产生相互作用，不能激活报告基因的表达。AI，的浓度gen公司酵母双杂交实验指南，将pDEST32一X酵母菌株MaV203，培养于SC/一Le川一T甲八His三养基中验证自激活。并将其中的阳性克隆分别、30、40、50mM的3AT浓度梯度培养皿中观则以ZmM梯度继续细分3AT浓度观察其生长构建NotI/sall双酶切定向克隆到pENTRll质粒中期相符(图1)。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62

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本文编号：2683460