乙型肝炎感染者肝门淋巴结内HBV DNA存在形式的实验观察

发布时间：2020-05-28 03:45

【摘要】：[目的]检测乙型肝炎病毒染者肝门淋巴结内HBV DNA和HBVcccDNA及乙肝表面抗原,明确肝门淋巴结内HBV的DNA分子存在形式及乙肝表面抗原表达情况,探讨肝门淋巴结内HBV在肝移植术后乙肝复发过程中的作用。 [方法]实验分为三部分。第一部分：建立检测肝门淋巴结内HBV DNA和HBV cccDNA的检测体系。根据入组病例的种族和地理分布特点,在Gen Bank选取HBV的B型、C型全基因序,对比序列差异,在S区、C区、X区内选择相对保守的区域各设计一对巢式或半巢式引物,当样本在两个或三个区域为阳性时,认为该样本HBV DNA为阳性；根据cccDNA的结构和生物学特点,利用PSAD消化去除rcDNA和整合型HBV DNA的干扰后,利用跨越缺口的选择性引物扩增。以pCP1O质粒为阳性对照,对肝组织样本DNA提取样本进行检测,确定引物的最佳退火温度和检测灵敏度。第二部分：慢性乙型肝炎相关肝移植受者肝门淋巴结的检测。选取病例为2010年6月至2011年3月因乙肝相关性终末期肝病于我院行肝移植手术患者共36例,其中男性32例,女性4例,年龄40-65岁,平均54.4±6.8岁,所有患者均为血清HBsAg阳性且HBV DNA定量检测阴性(小于100IU/mL为的检测下限)。利用第一部分创建的方法,检测肝门淋巴结内的HBV DNA及cccDNA。第三部分：HBsAg阳性肝移植供者肝门淋巴结的检测。2010年6月至2011年7月,摘取自HBsAg阳性供者的肝门淋巴结样本共9例。利用第一部分建立的方法检测肝门淋巴结内HBV DNA和cccDNA。利用免疫组化和酶联免疫吸附法测定肝门淋巴结内HBsAg的表达。实验结果采用t检验和Fisher确切概率法分析。 [结果] 第一部分：成功建立了检测肝门淋巴结内HBV DNA和cccDNA的PCR体系。第二部分：36例慢性乙型肝炎肝移植受者中,30例HBV DNA刚性,阳性率为83.3%(30/36),HBV DNA的三个独立检测区域,S区、C区和X区阳性率分别为86.1%(31/36)、86.1%(31/36)、66.7%(24/36)。17例HBV cccDNA阳性,阳性率47.2%(17/36)。对该组病例,根据术前是否应用核苷类药物,分为用药组(22入)和未用药组(14人),其中用药组分为用药时间3个月(14人)和≤3个月(8人)两个亚组。HBV DNA阳性率：用药组(72.7%,16/22)与未用药组(100%,14/14)差异无显著的统计学意义(P=0.062),用药组中用药时间3个月(71.4%,10/14)与≤3个月(75%,6/8)组间差异无显著的统计学意义(P=1.000)。HBV cccDNA阳性率：用药组(22.7%,5/22)较未用药组(85.7%,12/14)显著降低(P=0.000),用药组中用药时间3个月组(7.1%,1/14)较≤3个月组(50%,4/8)显著降低(P=0.039)。第三部分：9例HBsAg阳性肝移植供者中,7例HBV DNA阳性,阳性率为77.8%,HBV DNA三个独立检测区域,S区、C区和x区阳性率分别为77.8%(7/9)、77.8%(7/9)、66.7%(6/9)。5例HBV cccDNA阳性,阳性率55.6%。HBV DNA (P=0.651)及cccDNA (P=0.722)阳性率与第二部无显著性差异。免疫组化结果为可观察到少量疑似阳性细胞,分布零散。乙肝表面抗原酶联免疫：3个检测呈阳性,阳性率33.3%(3/9),低于肝门淋巴结中HBV DNA和HBV cccDNA的检出率 [结论] 1.成功建立了检测肝门淋巴结内HBV DNA和HBV cccDNA的PCR体系,杂带产生较少,方法灵敏度高,可用于相关研究。 2.对HBV感染者,HBV可感染其肝门淋巴结,肝门淋巴结可能为HBV的肝外储库之一,并可能为肝移植术后乙型肝炎病毒复发的原因之 3.对血清中HBV DNA滴度低于临床检测限的慢性乙肝患者,核苷类药物应用3个月以上可显著降低肝门淋巴结内cccDNA的检出率,表明肝移植术前核苷类药物的应用在减少肝外HBV病毒库方面是有意义的。 4.对HBsAg阳性的HBV感染者,肝门淋巴结内乙型肝炎病毒表面抗原的表达可能受到抑制,需进一步扩大病例观察。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

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