没食子酸卵磷脂复合物的制备及对小鼠酒精性肝病铁过载保护作用研究

发布时间：2020-05-28 15:07

【摘要】：目的:没食子酸(GA)作为食品领域常用的抗氧化剂,其生物活性的开发及应用尚未深入展开。本研究拟通过制备的GA-卵磷脂复合物扩展没食子酸生物活性的应用,并利用计算机模拟方法分析复合物可能具备的生物活性,为这一天然植物活性成分的实际应用提供新的思路和研究基础。此外,酒精相关的癌症死亡率占全世界所有癌症死亡率的5.8%,而酒精性肝病(ALD)在现代社会也有着非常高的罹患率、死亡率。本文拟通过研究没食子酸-卵磷脂复合物对酒精性肝病铁过载的保护作用,探讨其可能的作用机制,为ALD患者的临床治疗提供实验数据和理论依据。方法:第一部分:通过单因素(One-factor)实验,寻找影响以大豆卵磷脂为载体的GA-磷脂复合物的实验因素并利用响应面优化法优化GA-磷脂复合物制备方案。使用紫外分光光度法、红外分光光度法、差示扫描量热法、X射线衍射相分析法以及扫描电镜法等分析化学技术对所制备的物质进行表征与分析。最后通过测定复合物的表观油水分配系数观察复合物的脂溶性。第二部分:运用理论化学方法建立一个可预测分子间相互作用的计算机模拟模型考察复合物的分子结构、明确复合物中没食子酸分子与卵磷脂分子之间的结合方式,并采用分子动力学方法观察复合物分子分别在酒精和水条件下与其靶蛋白的亲和度。第三部分:分别从DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、亚油酸自氧化抑制能力、Fenton羟自由基清除能力和对Fe~(3+)的还原能力5个方面对GA-磷脂复合物的体外抗氧化活性进行研究。第四部分:通过酒精灌胃法建立了小鼠酒精性肝损伤铁过载模型,并用复合物进行干预。检测血清转氨酶、肝脏脂质代谢、抗氧化、铁代谢等生化指标,考察GA-卵磷脂复合物对酒精性肝铁过载的保护作用,并通过分析肝脏铁相关蛋白的表达情况,初步探讨其对ALD铁过载保护作用的可能机制。结果:(1)经单因素实验和响应面优化研究发现,影响GA-卵磷脂复合物制备的实验因素为GA与卵磷脂的物质的量比、反应温度、反应时间和GA的质量浓度。将响应面优化的数学模型和实验室条件相结合,确定了GA磷脂复合物的制备条件:即选用15 mL乙醇为反应溶剂(GA质量浓度为12.5 mg/mL),1比1作为GA与磷脂的物质的量比,50°C作为反应温度,3h作为反应时间。通过表征可以确定,利用优化的制备条件可以获得高复合率的GA磷脂复合物,该复合物的理化性质不同于GA或卵磷脂单体。通过表观油水分配系数的测定,结果表明GA的磷脂复合物在观察的pH范围内均具有较好的脂溶性(-1lg P2)。(2)通过GaMD和分子动力学模拟证明了GA-磷脂复合物的结合机理,即二者是通过强力的氢键相结合的,磷脂分子通过其脂肪链的卷曲将没食子酸分子包裹,使其完全分散于磷脂的物相中。通过对复合物-靶蛋白体系建模,经分子动力学模拟后发现乙醇环境对hPTP蛋白质的结构产生重大影响,而无论在乙醇还是水溶液环境下,复合物对维持其靶蛋白hPTP的构型稳定都具有积极作用。参照自由能的计算结果,研究发现范德华作用能(?Gvdw)、库仑力自由能(?Gele)、非极性溶剂自由能(?Gsurf)以及熵值(T?S)均对复合物-靶蛋白体系的结合产生贡献,而极性溶剂自由能(?GGB)易使体系温度产生波动,并且范德华作用能为整个体系的形成提供了主要能量。通过自由能分解结果可知,氨基酸残基Ile34、Ile181、Val49、Val96、Val189、Arg71、Trp94、Tyr107、Tyr148、Leu152、Met166、Pro172、Phe192均有着较高的结合自由能,说明它们可能参与了复合物与靶蛋白的紧密结合。(3)通过体外抗氧化性研究发现,除亚油酸自氧化抑制试验外,复合物的抗氧化能力均低于没食子酸单体,但是GA-卵磷脂复合物仍呈现出一定的自由基清除能力。亚油酸自氧化体系抑制能力的结果表明,随着诱导时间的延长,复合物抑制曲线的波动最为平缓,其抗氧化稳定性较没食子酸单体有所提高。通过Fenton羟自由基清除能力和对Fe~(3+)的还原能力实验可知,复合物仍具备良好的螯合铁特性。(4)体内活性研究中,首先进行了GA-卵磷脂复合物的经口急性毒性试验,结果发现给药剂量为5000 mg/kg BW的小鼠在实验观察期间内未出现任何不良反应与死亡。随后,结合文献资料和预实验结果选择100 mg/kg BW、200 mg/kg BW和400 mg/kg BW作为GA-卵磷脂复合物的干预剂量。经12w的酒精干预,相较于空白组,ALD模型组小鼠的血清转氨酶升高(P0.05)、肝脏脂质过氧化加重(P0.05)、脂质水平明显增高(P0.05)、肝细胞ROS水平和铁含量激增(P0.05),出现肝脏铁过载现象;病理切片观察发现小鼠肝细胞有大量脂肪蓄积,甚至出现纤维化改变。说明本研究的造模方法可以成功建立小鼠ALD铁过载模型。而相较于模型组,复合物能有效减轻酒精摄入诱导小鼠的肝脏损伤以及铁过载(P0.05),复合物中剂量组(200 mg/kg BW)的表现与空白对照组最为接近。检测ALD小鼠肝脏铁代谢相关蛋白,发现相较于空白组,乙醇可诱导Ferritin-light、TfR1的表达增高并降低Hepcidin的表达(P0.05);而相较于模型组,复合物可有效改善乙醇对上述蛋白的影响。结论:(1)通过单因素实验和响应面优化,确定了GA-卵磷脂复合物制备的最佳条件。对GA-卵磷脂复合物进行表征,发现其具有不同于原材料的理化性质。通过计算机模拟,证实了GA分子与卵磷脂分子是通过强氢键进行结合形成的复合物,并获得了复合物的分子构型;通过分子动力学模拟,证明其能与靶蛋白hPTP有效结合,在乙醇环境下具有稳定靶蛋白结构的功能,预测GA-卵磷脂复合物在生物体内可能具有积极的生物活性。(2)通过体外抗氧化性研究,发现GA-卵磷脂复合物能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基、Fenton反应产生的羟自由基,并能有效抑制亚油酸的自氧化,且具有一定的还原Fe~(3+)的能力。(3)成功建立了ALD小鼠肝损伤铁过载模型,并证明GA-卵磷脂复合物能抑制酒精诱导产生的血清转氨酶升高、脂质过氧化和氧化应激产生的ROS,并且有效改善小鼠血清铁和肝脏铁的过载状态,对酒精诱导的ALD小鼠肝损伤和铁过载具有保护作用。(4)GA-卵磷脂复合物能改善ALD小鼠的肝铁过载,推测可能与Ferritin-light和TfR1蛋白的下调以及Hepcidin的上调有关,但其改善ALD铁过载的具体机制需要进一步阐明;此外,本研究中GA-卵磷脂复合物200 mg/kg BW剂量组对ALD小鼠肝铁过载显示出较好的保护作用。
【图文】：

双体系,乙醇,环境,计算结果

第 3 章没食子酸卵磷脂复合物结构及其生物学活性的计算机模拟研究Root mean square deviation, RMSD）的计算可对模拟后两个体系的整体稳定行评估。经 RMSD 计算，乙醇环境系下，，Apo-hPTP 体系结构相较omplex-hPTP 出现了较大改变，如图 3.7（A）所示；同时，本研究也对上述体系进行了水环境下的 MD 模拟，如图 3.7（B）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.4;R575

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