双环醇调控自噬及抗氧化应激参与保护肝损伤的机制研究

发布时间：2020-05-29 09:07

【摘要】：目的:急性肝损伤是各种因素导致的肝脏急性损害,转氨酶升高,肝功能异常。双环醇已在临床上广泛应用,有明确的保肝降酶效果。既往已发现的双环醇保肝机制有:保护肝细胞膜和线粒体功能,清除自由基,抑制内质网应激,诱导热休克蛋白表达,抑制炎症因子释放等。自噬是真核细胞在遭遇饥饿、损伤、缺氧等影响细胞生存的条件下产生的一种自我保护机制。既往研究中发现在急性肝损伤中有自噬的发生。双环醇保肝机制是否有自噬参与研究尚少。本研究用CCl_4诱导C57BL/6小鼠急性肝损伤并加用双环醇预保护,评估双环醇对小鼠肝脏自噬通路及抗氧化应激相关通路指标的影响。探索自噬及抗氧化应激在双环醇保肝机制中所起的作用。方法:1、动物实验:腹腔注射体积比50%的CCl_4 40ul诱发急性肝损的模型。30只6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分成五组:正常组,CCl_4 24 h组,CCl_4 48 h组,CCl_4+双环醇24 h组,CCl_4+双环醇48 h组。于CCl_4给药后24h、48h分别处死相应组小鼠,留取血及肝脏标本,检测血清ALT变化。HE染色评价鼠肝的病理结构的变化。Western Blot检测肝脏自噬通路相关蛋白Atg12、Atg7、Atg5、p62、LC3、Beclin-1、mTOR等的改变情况。透射电镜观察肝细胞内自噬体及自噬溶酶体的变化。RT-PCR检测抗氧化应激相关分子在mRNA水平的变化。2、细胞实验:使用HepG2细胞诱导细胞损伤模型,双环醇或3-MA预先处理。CCl_4刺激2h后提蛋白,Western Blot检测mTOR、p62、LC3等自噬相关蛋白的表达。将已构建好的GFP-LC3质粒转染进HepG2细胞,单用双环醇刺激及合用双环醇和3-MA刺激细胞进行比较。荧光显微镜下观察拍照并计数绿色荧光点的数量。3、全部数据应用SPSS20.0软件分析,p0.05认为有统计学意义。结果:1、动物实验中,通过血清学分析发现,CCl_4造模组小鼠血清ALT较正常组明显升高(P0.001),CCl_4造模后双环醇治疗组ALT较造模组显著降低(P0.001)。通过病理学分析发现,正常组小鼠肝脏病理未见异常,CCl_4造模组小鼠肝脏病理可见细胞变性坏死,双环醇治疗组病理显示变性坏死得到明显修复。2、动物实验中,将肝组织蛋白提取,进行自噬相关蛋白分析发现,与正常组和CCl_4造模48h组比,双环醇治疗24h及48h组Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62在蛋白水平明显升高,P-mTOR明显下降(P0.05)。CCl_4造模24h组也可见p62及LC3 II蛋白水平升高。Atg5和Atg12未见显著改变。3、动物实验中,提取肝组织mRNA,进行基因水平分析发现,与正常组和CCl_4造模组比,CCl_4+双环醇治疗组肝组织的抗氧化应激相关分子HO-1、NQO1、GSTA-1在mRNA水平明显升高,Keap1及p62在mRNA水平也上调(P0.01)。4、细胞实验中,与正常组相比,CCl_4+双环醇治疗组p62、P-mTOR蛋白水平下调,LC3 II上调(P0.05),以上变化可被自噬抑制剂3-MA逆转。荧光显微镜下进一步验证,向HepG2细胞转染载有GFP-LC3基因的质粒,双环醇治疗组绿色荧光点(表示自噬体)较正常组明显增多,加3-MA抑制后荧光点数量减少(P0.01)。结论:在急性肝损伤治疗中,双环醇可使血清ALT明显下降,使变性坏死的肝组织明显改善。这种改善与自噬通路相关,其中自噬相关蛋白Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62、P-mTOR起到关键作用。同时发现该通路中p62与Keap1-Nrf2抗氧化应激通路有关,与其下游HO-1、NQO1、GSTA-1分子相关,进而使肝细胞抗氧化应激能力增强。总之,双环醇通过上调肝细胞自噬水平及加强抗氧化应激能力来保护CCl_4诱导的急性肝损伤。
【图文】：

前言毒感染、化学性毒物、肝毒性药灌注损伤等原因引起的肝功能异酶升高，影响肝细胞功能，可发合物，其诱导的肝损伤模型是一最终进入肝内，经肝微粒体细胞·和过氧化三氯甲基自由基 OO质网膜上的磷脂分子发生共价结影响线粒体代谢，，产生活性氧，等最终引起广泛肝损伤[3]。

真核细胞内自噬的基本过程
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575

【参考文献】

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1 刘诗o

本文编号：2686711