胆汁淤积下水通道蛋白AQP10下调的功能及分子机制研究

发布时间：2020-05-29 16:47

【摘要】：背景和目的胆汁淤积(cholestasis)是由于胆汁分泌及排泄障碍,包括胆汁酸合成的异常和胆酸转运蛋白表达异常而导致的复杂临床综合症,伴随着病情的发生发展可能会出现肝纤维化、肝硬化,甚至肝功衰竭的现象。在过去的研究中人们对胆汁淤积发生的分子机制研究取得了很大进展,但研究对象多集中于胆酸转运蛋白和胆汁酸合成关键蛋白,而对于在胆汁中含量占比最多的水以及转运水的通道蛋白在胆汁淤积中的功能及作用机制研究较少。水通道蛋白10(Aquaporin 10，AQP10)是水通道家族中的一员,和AQP3,AQP7，AQP8，AQP9同属于水-甘油通道亚家族,这类水通道蛋白除转运水分子之外还转运甘油、尿素,在脂肪的代谢过程中也发挥重要作用。在以往的研究中发现AQP10表达在十二指肠和空肠[1]、脂肪组织和皮肤[2],脂肪代谢异常和一些痕疹样皮肤病的发生和AQP10表达异常有关。但AQP10在胆汁淤积中的作用暂无研究。本文我们旨在研究水通道蛋白10(Aquaporin10，AQP10)在胆汁淤积患者肝脏中的表达变化、产生此效应的作用机制以及其相关的功能研究。方法1.我们通过蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)、实时定量逆转录PCR(Reverse transcription-PCR，RT-qPCR)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)确定AQP10在胆汁淤积患者肝细胞表达情况,并分析了患者的血清生化各项指标数据与患者肝脏AQP10表达量之间的相关性。2.构建体外胆汁淤积的细胞模型PLC/PRF/5-ASBT稳转细胞株(Apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT),使用NF-κB抑制剂预处理细胞后再检测细胞AQP10的mRNA水平和蛋白水平的表达。随后,采用双荧光素酶基因报告和染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)研究发生此效应的机制.3.构建PLC/PRF/5-ASBTAQP10过表达稳转细胞株,使用结合型胆汁酸处理后,检测细胞内胆汁酸的含量。结果1.胆汁淤积患者肝脏细胞AQP10的表达量比对照组患者降低1倍。胆汁淤积患者血清及肝组织总胆汁酸含量与患者肝组织AQP10表达量呈负相关。2.结合型胆汁酸牛磺胆酸(Taurocholicacid,TCA)可激活信号NF-κB通路。双荧光素酶基因报告证明核转录因子NF-κB(Nuclear factor Kappa B，NF-κB)与AQP10启动子的结合位点位于AQP10启动子的~434bp/-2285P。ChIP实验结果表明,NF-κB直接负向调控AQP的表达。3.相同浓度结合型胆汁酸处理细胞后,与PLC/PRF/5-ASBT细胞相比,PLC/PRF/5-ASBTAQP10细胞内总胆酸含量明显降低。结论在胆汁淤积情况下,结合型胆汁酸TCA可激活NF-κB信号通路,NF-κB可直接结合到AQP10启动子-434bp至-228bp区域,下调肝脏AQP10表达。
【图文】：

氨基酸序列,水通道蛋白,动植物,结构示意图

水分子转运的效率高达３０亿个／秒，在尿液重吸收、脂肪吸收和脑脊逡逑液的形成流动等过程发挥重要作用。后续研究发现的具有特异转运水功能的膜逡逑通道蛋白被统称为ＡＱＰ。在结构上，ＡＱＰ具有六个跨膜结构域（图１．１），其逡逑中ＮＨ２－和ＣＯＯＨ－末端位于细胞质中。水通道蛋白的一级结构是跨膜６次的单肽逡逑链（图１．１．１邋Ａ＿Ｂ），氨基酸序列高度保守，含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（Ａｓｎ－逡逑Ｐｒｏ－Ａｌａ，ＮＰＡ）重复序列它们是ＡＱＰ的特征序列［２１］。ＡＱＰ的高级结构由同源四聚逡逑１逡逑

氨基酸序列,胆汁酸,肝损害,固醇

水分子转运的效率高达３０亿个／秒，在尿液重吸收、脂肪吸收和脑脊逡逑液的形成流动等过程发挥重要作用。后续研究发现的具有特异转运水功能的膜逡逑通道蛋白被统称为ＡＱＰ。在结构上，ＡＱＰ具有六个跨膜结构域（图１．１），，其逡逑中ＮＨ２－和ＣＯＯＨ－末端位于细胞质中。水通道蛋白的一级结构是跨膜６次的单肽逡逑链（图１．１．１邋Ａ＿Ｂ），氨基酸序列高度保守，含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（Ａｓｎ－逡逑Ｐｒｏ－Ａｌａ，ＮＰＡ）重复序列它们是ＡＱＰ的特征序列［２１］。ＡＱＰ的高级结构由同源四聚逡逑１逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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