胃内菌群对H.pylori定植的影响和双歧杆菌治疗H.pylori感染的有效性研究

发布时间：2020-05-30 12:08

【摘要】： 目的 将一株从健康人体十二指肠液标本中分离出的双歧杆菌CMS005行体外抗Hp的抑菌试验及耐酸耐胆汁试验，以考察其是否具备治疗Hp感染的条件，并对其进行鉴定。 方法 将已有的双歧杆菌CMS005菌株混悬液用平板打孔法(孔径7mm)行体外抗Hp的抑菌试验，根据抑菌圈直径判断体外抑制Hp作用，并行耐酸耐胆汁试验，将此菌株接种在不同pH值的MRS液体培养基中和含牛胆汁的MRS液体培养基中，每隔30分钟取样进行活菌计数，作为衡量其生长状况的指标。并将此菌株进行药敏试验以及遗传特性的鉴定等。 结果 1．CMS005菌株的细菌混悬液对Hp有明显抑菌作用，其最小抑菌浓度为1×10~7CFU／ml。浓度为1×10~8CFU／ml的CMS005菌株抑菌效果与浓度为0.25mg／ml的氨苄青霉素相比较无显著性差异(P＞0.05)。 2．CMS005菌株在pH值为2.5及以上的酸性环境下生长较好，在pH值为2.0及以下的酸性环境中生长受到抑制；在含牛胆汁的MRS液体培养基中生长良好，与在不含牛胆汁的MRS液体培养基中比较活菌计数无显著性差异(P＞0.05)。 结论 从健康人体十二指肠液中分离出的双歧杆菌CMS005为益生菌株，其混悬液具有明显的体外抗Hp效果。CMS005具有较好的胃酸和胆汁抗性。可将其进一步用于抗Hp的体内试验。 第二章胃内不同微生态条件下建立H．pylori感染SPF级BALB／c小鼠胃炎模型的效果比较 目的 选取胃内菌群相对较少的SPF级BalB／C小鼠，预先用抗生素灌胃以破坏其原籍菌群，从而导致小鼠胃内微生态的失衡，再用Hp标准株感染小鼠，使得Hp得以在小鼠胃内顺利定植。和现有的Hp菌液直接灌胃造模法比较成模效果的差别。分析造模前后小鼠胃内菌群的变化，探讨菌群失衡在Hp感染小鼠过程中的作用，为Hp可能为条件致病菌的假设提供理论依据。并以此建立一种造模周期短且可靠的Hp感染的慢性胃炎模型。 方法 60只SPF级BALB／c小鼠随机分为6组，第1组、第2组均用抗生素预处理后再予Hp菌悬液灌胃造模，为抗生素造模组，第3组、第4组予Hp菌悬液灌胃对照，为直接造模组，第5组、第6组为生理盐水对照组。第1组、第3组和第5组于灌胃后4周处死；第2组、第4组和第6组于灌胃后8周处死。用快速尿素酶试验、Giemsa染色和微需氧细菌培养检测Hp定植，用涂片革兰氏染色镜检和选择性培养基培养法分析造模前后小鼠胃和十二指肠菌群的变化，用H-E染色检查小鼠胃粘膜病理组织学改变。 结果 1．Hp感染结果：抗生素造模组中第1组、第2组小鼠胃内Hp感染率均为100％，其中第2组小鼠的Hp定植量较第1组显著增加(P＜0.05)。直接造模组中第3组小鼠胃内Hp感染率为60％、第4组小鼠胃内Hp感染率为50％。第3组小鼠的Hp定植量和第4组无明显差异(P＞0.05)。生理盐水对照组中第5组、第6组小鼠胃内均未检测到Hp定植。4周时抗生素造模组的Hp定植量较直接造模组明显为高(P＜0.05)，8周时抗生素造模组的Hp感染率较直接造模组明显为高(P＜0.05)。抗生素造模组和直接造模组的Hp感染率与生理盐水对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。 2．菌群分析结果：抗生素造模组小鼠胃内细菌总数量为10~4～10~5CFU／g组织，直接造模组小鼠胃内细菌总数量为10~5～10~6CFU／g组织，生理盐水对照组小鼠内细菌总数量为10~5～10~6CFU／g组织。抗生素造模组的各种细菌数与生理盐水对照组和直接造模组相比显著下降(P＜0.05)，生理盐水对照组和直接造模组各种细菌数二者比较无显著性差异(P＞0.05)。 3．病理组织学结果：抗生素造模组第1组、第2组小鼠胃粘膜均有炎症改变，且第2组小鼠较第1组小鼠炎症程度明显加重(P＜0.05)。直接造模组第3组、第4组小鼠粘膜均有炎症改变，第3组和第4组小鼠的胃粘膜炎症程度无明显差异(P＞0.05)。抗生素造模组第1组小鼠较直接造模组第3、4组小鼠胃粘膜炎症程度明显加重(P＜0.05)，抗生素造模组第2组小鼠亦较直接造模组第3、4组小鼠胃粘膜炎症程度明显加重(P＜0.05)。抗生素造模组和直接造模组小鼠胃粘膜炎症程度与生理盐水对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。 结论 本实验用抗生素灌胃可破坏小鼠原籍菌群，使其胃和十二指肠菌群微生态失衡，从而促进Hp的定植。此种造模方法效果好于已有的Hp菌悬液直接灌胃造模法，提示Hp感染与胃内菌群状态有关，Hp可能为条件致病菌，胃内微生态失衡有利于Hp的感染和定植。用此法可成功建立Hp标准株感染SPF级BALB／c小鼠的造模周期短而稳定的慢性胃炎模型。 第三章双歧杆菌CMS005与PPI合用治疗H．pylori感染性胃炎的体内有效性及对胃内菌群的影响研究 目的 用本试验第二部分中的抗生素预处理法建立Hp感染的SPF级BALB／c小鼠慢性胃炎模型，再用本试验第一部分已鉴定的双歧杆菌CMS005菌液灌胃治疗，并和现有的根除Hp三联疗法相比较，观察其对Hp感染的慢性胃炎治疗的有效性。分析治疗前后小鼠胃内菌群的变化，探讨纠正菌群失衡在治疗Hp感染慢性胃炎中的作用，为Hp可能为条件致病菌的假设进一步提供理论依据。 方法 50只SPF级BALB／c小鼠随机分为5组，第1组至第4组均用抗生素预处理后再Hp菌悬液灌胃造模，造模后4周开始治疗，第1组为CMS005治疗组，第2组为CMS005＋质子泵药物治疗组，第3组为抗生素＋质子泵药物治疗组，第4组为生理盐水对照组，第5组为正常对照组，治疗2周后处死小鼠。小鼠处死后用快速尿素酶试验、Giemsa染色和微需氧细菌培养检测Hp定植，作为治疗是否有效的标准；用涂片革兰氏染色镜检和选择性培养基培养法分析治疗前后小鼠胃和十二指肠菌群的变化，用H-E染色检查小鼠胃粘膜病理组织学改变。 结果 1．根除Hp结果：CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组小鼠胃内Hp感染率均为30％，根除率分别为60％和70％，抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃内Hp感染率为20％，根除率为80％。生理盐水对照组根除率为0。CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组均能有效根除Hp(P＜0.05)，且与抗生素＋质子泵药物治疗组无显著性差别(P＞0.05)。CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组三组小鼠胃内Hp定植量均极少，互相之间无显著性差异(P＞0.05)。 2．菌群分析结果：CMS005治疗组小鼠胃内细菌总数量为10~6～10~7CFU／g组织，CMS005＋质子泵药物治疗组小鼠胃内细菌总数量为10~6～10~7CFU／g组织，抗生素＋质子泵药物治疗组与生理盐水对照组小鼠胃内细菌总数量为10~4～10~5CFU／g组织，正常对照组小鼠胃内细菌总数量均为10~5～10~6CFU／g组织。抗生素＋质子泵药物治疗组与生理盐水对照组的各种细菌数与正常对照组相比显著下降(P＜0.05)，而CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组的双歧杆菌数与正常对照组相比显著升高(P＜0.05)，CMS005＋质子泵药物治疗组的双歧杆菌数与单用CMS005治疗组比较亦显著升高(P＜0.05)。CMS005＋质子泵药物治疗组的各种细菌数量均较正常对照组显著升高(P＜0.05)。 3．病理组织学结果：CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃粘膜炎症均较生理盐水对照组明显好转(P＜0.05)，但与正常对照组有明显差别(P＜0.05)。CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组三组小鼠胃粘膜炎症无显著性差异(P＞0.05)。 结论 CMS005用于治疗Hp感染的慢性胃炎有明显效果，对Hp的根除率与传统三联疗法比较无明显差别，，且与质子泵药物合用效果更佳。对于Hp感染的胃粘膜炎症治疗效果明显，与传统三联疗法比较无明显差别。CMS005能够显著提高胃内双歧杆菌数量，而与质子泵药物合用则能提高多种正常细菌数量。 第四章TLR4在H．pylori致病机制中的作用和双歧杆菌CMS005治疗H．pylori感染性胃炎的机制探讨 目的 比较Hp感染性胃炎的小鼠和用双歧杆菌CMS005治疗后的小鼠胃粘膜内TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因和蛋白水平上的表达含量变化，分析IL-1β、TNF-a、IL-12等炎症因子和TLR4之间的相关性。探讨TLR4在Hp致病机制中的作用和双歧杆菌CMS005治疗Hp感染性胃炎的机制。 方法 取试验第三部分的各组小鼠胃粘膜标本，用RT-PCR的方法半定量检测TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因水平上的表达，用Westernblotting法半定量检测TLR4、IL-1β在蛋白水平上的表达，用免疫组织化学的方法检测IL-1β和IL-12在蛋白水平上的表达。 结果 1．在基因和蛋白水平，CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃粘膜内TLR4的表达均较生理盐水对照组明显降低(P＜0.05)。 2．在基因和蛋白水平，CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃粘膜组织中IL-1β的表达均较生理盐水对照组明显降低(P＜0.05)，但均较正常对照组明显升高(P＜0.05)。 3．在基因和蛋白水平，CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃粘膜组织中IL-12的表达均较生理盐水对照组明显降低(P＜0.05)。 4．在基因水平，CMS005治疗组和CMS005＋质子泵药物治疗组、抗生素＋质子泵药物治疗组小鼠胃粘膜组织中TNF-a的表达均较生理盐水对照组明显降低(P＜0.05)。 5．TLR4与IL-1β、TNF-a、IL-12均呈正相关。 结论 TLR4参与了Hp的致病机制，并且与IL-1β、TNF-a呈正相关，提示TLR4通路与下游的IL-1β、TNF-a、IL-12炎症因子的激活相关。双歧杆菌CMS005治疗Hp感染性胃炎的机制之一是通过TLR4信号途径起作用。
【图文】：

氨节西林钠、0.smg/ml的甲硝哇(P<0.05)。氨节西林钠血药浓度峰值一般不大于0.02mg/ml，可见CMs005菌液的抑菌效果已明显强于氨节西林钠血药浓度的抑菌效果。结果见表1一1，图1一4、1一5。表1一1为不同浓度的CMSO05与氨节西林钠和甲硝哇对HP体外抑制作用的比较，其比较值为抑菌圈直径，直径为7~时即为孔径大小而无抑菌圈产生，CMSO05菌液的浓度一、二、三、四分别为l.oxl09CFU加】、l.oxl08CFU加l、 l.oxl07CFU/lnl、1.oxl06CFU加l，氨节西林钠的浓度一、二、三、四分别为25mg/ml、2.smg/inl、o.25mg/ml、o.o25mg/ml，甲硝哇的浓度一、二、三、四分别为smg/ml、0.smg/ml、o.osmg/ml、o.005mg/ml。

b:与 0.2smg/ml的氨千西林钠、0.05mg/ml的甲峭哇抑菌圈大小有统计学差异(P<0.05)AB图1一4以5005与氨千西林钠对HP的体外抑制作用A图为氨节西林钠对HP的抑菌圈，其中1号孔为25mg/ml浓度，抑菌圈为45~;2号孔为2.smg/ml浓度，抑菌圈为26~;3号孔为0.25m创ml浓度，抑菌圈为14~;4号孔为0.025mg/ml浓度，无抑菌圈产生;B图为CMs005对饰的抑菌圈，其中1号孔为 1.oxlogeFU厄d浓度，抑菌圈为17nun;2号孔为l.oxloserUllnl浓度
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R573

【引证文献】

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1 张玲;杨彩梅;曹广添;肖英平;曾新福;;Toll样受体与益生菌免疫[J];动物营养学报;2013年01期

本文编号：2688108