亲环素D的表达增加诱发肝脏脂质沉积的机制研究

发布时间：2020-05-30 16:06

【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪肝是最常见的慢性肝脏疾病之一,其发病及进展过程极其复杂。肝脏的脂质沉积(肝脂肪变)是大家公认的非酒精性脂肪肝的早期阶段;肝脏甘油三酯的从头合成增加是非酒精性脂肪肝最重要的病理特征,也是导致肝脏脂质沉积的关键原因。越来越多的研究认为非酒精性脂肪肝可能是一种线粒体疾病,但线粒体功能在肝脏脂质沉积中的具体作用仍不明确。线粒体通透性转换孔生理性开放对维持线粒体功能和细胞稳态起着至关重要的作用;其过度的、不可逆的开放将会导致线粒体应激和功能紊乱,表现为呼吸链障碍、线粒体肿胀和活性氧蓄积。亲环素D(CypD),一种位于线粒体基质的肽辅氨酰异构酶,是调控通透性转换孔开放的始动因子,但CypD表达的异常增加会导致通透性转换孔过度开放和线粒体应激。CypD缺失可以减轻刺激因素诱导的大脑皮层或骨骼肌的线粒体功能紊乱,改善阿尔兹海默病的学习、记忆障碍或胰岛素抵抗。这为研究CypD在肝脏脂质沉积中的作用提供理论基础。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是肝脏脂质合成的关键酶。我们以往的研究显示固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)在肝脏甘油三酯合成中发挥着不可或缺的作用。SREBP-1c前体通过高尔基体上的位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)催化裂解,成为有活性的SREBP-1c成熟体。SREBP-1c成熟体可以进入细胞核,结合下游基因特定的SRE序列,调控甘油三酯合成相关基因的转录。由于非酒精性脂肪肝可能是一种线粒体相关性疾病,线粒体应激与SREBP-1c是否存在联系尚需研究。内质网应激可以上调SREBP-1c的表达并激活脂质合成,CypD过度活化可以引起活性氧的蓄积、线粒体应激加重,导致细胞内Ca2+代谢紊乱。Ca2+代谢是联系线粒体和内质网的桥梁,丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)同样发挥着重要的连接作用。本课题研究发现CypD调控的线粒体应激可以引发肝脏甘油三酯的合成增加。其机制可能是CypD的表达增加引起通透性转换孔过度开放、线粒体应激加重,Ca2+代谢紊乱,进而通过p38MAPK影响内质网应激,最终导致SREBP-1c的表达和活性增加。目的:1、明确在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中CypD及甘油三酯增加的关系。2、通过运用CypD敲除的小鼠模型和尾静脉注射CypD过表达腺病毒的小鼠模型,证实CypD对肝脏线粒体应激和甘油三酯合成的作用。3、通过体内外实验证实CypD对肝脏SREBP-1c的上调作用。4、体内通过肝脏特异性Ire1α敲除小鼠模型、体外通过小干扰RNA和抑制剂处理,证实CypD通过IRE 1α上调肝脏SREBP-1c的表达。5、体内应用CypD抑制剂验证其对肝脏甘油三酯沉积的预防和治疗作用。研究方法:1、动物模型建立:(1)高脂饮食喂养的小鼠模型8周龄的雄性C57B1/6j小鼠分为两组进行实验,高脂组小鼠进食含60%kcal脂肪的高脂饮食,而对照组进食普通饮食。(2)全身CypD和SREBP-1c基因敲除小鼠在SPF环境饲养并采用杂合子繁殖同窝对照的野生型及敲除小鼠,基因型鉴定后,雄性小鼠约8周龄进行实验。(3)肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠Jre1α-LKO(肝脏特异性Ire1α基因敲除)小鼠是由lrelαflox/flox小鼠和Alb-Cre小鼠交配繁殖得到的。基因型鉴定后,各基因型雄性小鼠约8周龄进行实验。(4)CypD过表达小鼠模型小鼠AdPPIF(CypD过表达)病毒和空载病毒AdEGFP用无菌PBS稀释,以每只C57B1/6j小鼠2*108 pfu的量进行尾静脉注射,共注射三次,间隔六天。(5)环孢菌素A模型小鼠环孢菌素注射液即医用山地明(简称CsA)用无菌PBS稀释,以每只C57B1/6j小鼠10 mg·kg-1·d-1或20 mg·kg-1d-1的量进行腹腔注射;对照组注射相同体积的PBS。连续注射六周。(6)衣霉素模型小鼠先将衣霉素(Tm)用DMSO溶解成母液,浓度为10mg·ml-1,再用无菌PBS稀释母液。Tm组的注射方案是:以每只C57Bl/6j小鼠1 mg·kg-1·d-1的量进行腹腔注射;对照组注射相同体积的PBS。连续注射两天。2、细胞培养:HepG2细胞根据ATCC细胞培养标准进行培养,小鼠肝原代细胞按照两步胶原酶灌注法进行提取。3、小动物活体成像分析:通过小动物活体成像技术在活体水平观察特定刺激对CypD或SREBP-1c启动子区的调控作用。4、小鼠代谢笼分析:采用小鼠代谢笼分析方法检测特定刺激对小鼠全身水平代谢的影响。5、线粒体肿胀分析:分离肝脏组织线粒体,采用酶标仪检测特定刺激对钙离子触发的线粒体肿胀的影响。6、丙二醛含量分析:采用丙二醛(MDA)检测试剂盒检测特定刺激对肝组织脂质过氧化的影响。7、小鼠血糖、血脂及肝功检测指标:血糖、血脂(甘油三酯、总胆固醇)及ALT、AST,采用Mindrary全自动生化分析仪检测。8、采用试剂盒检测肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。9、电镜分析:采用透射电镜观察小鼠肝脏线粒体形态及脂质沉积。10、采用HE和油红O染色检测小鼠肝组织或细胞脂质沉积。11、线粒体活性氧染色:运用MitoSoxRed染料检测小鼠肝组织或细胞的线粒体活性氧。12、采用Real time-PCR技术检测SREBP-1c、Xbp-1等关键分子的基因表达。13、PCRarray分析:采用PCR芯片技术检测小鼠肝组织中脂肪肝相关基因的表达。14、采用 Western Blot 技术检测 CypD、p38MAPK、IRE1 α、SREBP-1c 等关键分子的蛋白表达。15、采用小鼠体温计检测小鼠体温。16、小鼠体脂分析:采用X-ray仪器分析小鼠体脂分数。17、线粒体能量代谢实验:采用seahorse线粒体能量分析仪器检测特定刺激对细胞线粒体氧耗等的影响。18、采用免疫荧光双染技术检测CypD蛋白在线粒体的表达,运用Fura2-AM染料检测细胞内钙离子。结果:1、肝脏脂质沉积继发于亲环素D(CypD)的表达增加用普通饮食或60kcal%的高脂饮食喂养小鼠,在第2、4、8、12周末观察肝脏脂质沉积和线粒体应激关键蛋白CypD的表达。动物活体成像和western blot显示,高脂喂养第4周末,肝脏CypD的荧光素酶活性及蛋白表达升高(p0.01),随喂养周数延长而增加。但直至第8周末,肝脏甘油三酯(TG)含量(p0.01)及脂质沉积才有显著增加;提示高脂喂养过程中,肝脏CypD的表达升高早于TG沉积,暗示了 CypD与肝脏脂质沉积的潜在相关性,为CypD在脂肪肝发病中的作用研究提供实验依据。2、CypD与肝脏线粒体应激和脂质沉积呈正相关为研究CypD与肝脏TG沉积的关系,我们引入全身CypD基因敲除小鼠模型和肝脏CypD过表达模型,在基因敲除模型中采用普通饮食和高脂饮食喂养。(1)全身代谢的分析代谢笼数据显示:普通饮食喂养下,CypD敲除鼠与野生型相比,氧耗和能量消耗无明显变化;而高脂喂养时,CypD敲除提高了小鼠的氧耗和能量消耗。另一方面,肝脏CypD过表达对小鼠氧耗和能量消耗的影响不大,提示CypD并不直接影响全身代谢水平。(2)血清学指标分析已有研究证实CypD敲除可缓解高脂诱导的胰岛素抵抗,我们的血清学结果显示,CypD敲除可降低高脂饮食下小鼠血清葡萄糖水平,而且血清TG水平也明显降低(p0.05);普通饮食情况下,CypD敲除对小鼠血脂的影响不大。(3)肝脏线粒体应激和脂质沉积分析普通饮食喂养下,CypD敲除鼠与野生型相比,肝脏TG水平略有下降,而CypD敲除可明显减轻高脂诱导的肝脏TG沉积(p0.01);CypD敲除对肝脏胆固醇水平无明显影响。同时我们观察CypD敲除对肝脏线粒体应激的影响:高脂喂养的野生型小鼠与普通饮食组相比,线粒体肿胀明显增强(0.05),CypD敲除消除了这种差异;CypD敲除也减少了线粒体活性氧的产生(p0.01)。另一方面,尾静脉注射CypD过表达组与空载病毒组相比,肝脏TG含量(p0.05)增加、肝脏线粒体肿胀(p0.05)和活性氧积聚加重。说明CypD敲除减轻了高脂诱导的肝脏线粒体应激和TG沉积,而肝脏CypD过表达可加重肝脏线粒体应激和TG沉积;提示肝脏TG沉积依赖于线粒体CypD的表达。3、CypD通过TG合成的关键酶SREBP-1c调控肝脏TG沉积通过PCR array筛选及qPCR验证,CypD敲除明显抑制了高脂诱导的肝脏SREBP-1c的mRNA表达(p0.05)。高脂喂养可以明显增加SREBP-1c前体(p-SREBP-1c)和成熟体(n-SREBP-1c)的蛋白表达;而CypD敲除消除了高脂对SREBP-1c的作用,提示CypD可能调控SREBP-1c。肝脏CypD过表达小鼠模型中,肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性和蛋白表达就空载病毒组明显升高;而SREBP-1c敲除也消除了 CypD过表达对TG的增加作用(p0.01),说明CypD通过SREBP-1c调控肝脏TG沉积。4、CypD通过内质网应激关键分子IRE1α调控肝脏SREBP-1c表达研究显示CypD引起的活性氧积聚可激活p38 MAPK,而p38 MAPK又是联系线粒体应激和内质网应激的桥梁。我们的研究显示,CypD敲除可减少高脂诱导的肝脏p38MAPK、磷酸化IRE1α蛋白表达,并缓解内质网肿胀。在肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠模型中,CypD无法上调肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性、蛋白表达及脂质沉积。说明在CypD诱导SREBP-1c表达的过程中IRE1α发挥不可或缺的作用,在体内实验层面初步探讨CypD的作用机制。5、CypD 通过 Ca2+/p38 MAPK/IRE1α 通路调控 SREBP-1c我们分别在小鼠肝原代和人HepG2细胞上发现,CypD依次通过调控细胞内Ca2+含量、活性氧积聚,激活p38 MAPK/IRE1α通路,增加肝脏SREBP-1c的mRNA(p0.01)、蛋白表达及TG沉积(p0.01)。分别应用p38 MAPK和IRE1α的抑制剂,以及肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠的原代细胞,在体外实验层面证实 CypD 通过 Ca2+/p38 MAPK/IRE1α 增加 SREBP-1c 的表达,揭示了 CypD 发挥作用的分子通路。6、CypD抑制剂对非酒精性脂肪肝的预防和治疗作用我们在体内应用CypD抑制剂---环孢菌素A(CsA),寻求脂肪肝的预防和治疗途径。运用高脂喂养的小鼠模型,分别在第4周和第30周末腹腔注射CsA,模拟肝脏脂质沉积发生之前和严重脂质沉积两个阶段。CsA减轻了两个阶段中高脂诱导的肝脏活性氧沉积,证明其发挥了抑制线粒体应激的作用;同时检测到CsA减少了肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性、蛋白表达以及TG含量(p0.01)。为了消除CsA的继发作用,我们在体外应用CypD的小干扰RNA,同样证实CypD抑制剂可减少肝脏SREBP-1c表达,为脂肪肝的防治提供了新的依据。结论:1、在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中,CypD的表达增加早于甘油三酯的沉积。2、CypD的表达增加可引发肝脏线粒体应激和甘油三酯沉积。3、CypD上调肝脏甘油三酯沉积的机制是通过Ca2+/p38 MAPK/IRE1α/SREBP-1c通路实现的。4、CypD抑制剂CsA可预防和治疗肝脏甘油三酯沉积,为NAFLD的防治提供新靶点。
【图文】：

小鼠,肝脏

图１高脂喂养小鼠的肝脏ＣｙｐＤ表达早于脂质沉积逡逑

线粒体,应激

图２邋ＣｙｐＤ敲除对小鼠肝脏线粒体应激和脂质沉积的影响逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.5

【参考文献】