Toll样受体表达和树突状细胞表型、功能在实验性结肠炎中的变化及益生菌的作用

发布时间：2020-05-31 06:23

【摘要】： 炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的病因和发病机制未明，严重危害健康，但缺乏特效治疗方法，因此IBD的机制和治疗的研究成为目前医学研究的热点。研究显示肠道菌丛在IBD的发病中起关键作用，使用益生菌治疗IBD有一定的疗效，但其机制尚不清楚。2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)引起的结肠炎为乙醇造成结肠粘膜损伤后暴露的结肠蛋白与TNBS结合后形成自身抗原，导致免疫异常引起炎症，其发病机制和临床病理改变与人类IBD相似，其作为IBD的动物模型被国内外广泛用于IBD的实验研究。本课题通过建立TNBS诱导的大鼠IBD模型，观察和探讨大鼠肠道部分菌群、内毒素水平、结肠TLR2、TLR4和NF-κBp65的表达及肠系膜淋巴结树突状细胞表型和功能的变化及其意义，并分析和探讨双歧三联活菌的作用。 第一部分实验性结肠炎大鼠结肠菌群和血浆内毒素水平的变化及双歧三联活菌的作用 目的 建立TNBS诱导的大鼠结肠炎模型，观察和分析其结肠炎症、菌群和血浆内毒素水平的变化及双歧三联活菌的作用，并与美沙拉嗪的作用进行比较。 方法 雄性Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(NC组)、阳性对照组(UC组)、双歧三联活菌治疗组(Bifico，BC组)和美沙拉嗪对照组(MC组)，每组10只，采用TNBS(100mg／kg)乙醇溶液一次性灌肠法建立大鼠结肠炎模型；双歧三联活菌(2.2×10~9CFU／只)和美沙拉嗪(200mg／只)治疗4周，邻甲联苯胺法检测大便隐血情况。实验结束时处死大鼠留取结肠及心脏采血分离血浆；HE染色观察各组大鼠结肠炎症情况，并盲法行炎症评分，对结肠内的部分细菌进行培养；鲎试验测定大鼠血浆内毒素水平，分析其变化，并观察该益生菌对大鼠结肠炎症、细菌和血浆内毒素水平的影响。 结果 1．一般情况 TNBS灌肠后大鼠活动减少，懒动；食欲和食量下降、厌食，毛发无光泽，并出现腹泻、粘液血便或隐血实验阳性、体重下降等；经Bifico和美沙拉嗪治疗4周后，活动及体重增加，腹泻及便血等症状好转；于第2周时，UC组、BC组和MC组分别死亡2只、1只和1只大鼠，这4只大鼠明显消瘦，腹部膨隆，解剖发现结肠局部增厚、水肿，与周围组织粘连，近端结肠和小肠明显扩张，肠壁变薄。NC组大鼠饮食和活动无明显异常，体重较其他三组增加。 2．结肠粘膜损伤情况 肉眼观察：UC组大鼠结肠与周围组织粘连明显，肠壁水肿、增厚，部分可见粘膜下出血；而BC组和MC组大鼠结肠与周围组织粘连较轻，水肿及肠壁厚度轻于UC组；BC组较MC组重；NC组大鼠结肠肉眼观察无明显异常。光镜下，UC组粘膜结构损伤明显，表现为广泛粘膜糜烂，隐窝炎及脓肿，腺管排列紊乱，固有层充血水肿明显，大量炎性细胞浸润，部分标本见大片组织坏死：BC组和MC组有明显的炎性细胞浸润，部分见隐窝炎，但腺管排列整齐，无明显脓肿及大片的组织坏死，BC组炎症浸润较MC组明显；NC组大鼠结肠有轻至中度炎性细胞浸润，但腺管排列整齐，无组织坏死及隐窝炎。 3．炎症评分 四组炎症评分分别为NC组：4.35±0.88，UC组：10.25±1.36，BC组：7.94±0.85和MC组：6.78±0.71。BC组和MC组大鼠结肠炎症评分明显低于UC组(P＜0.05和P＜0.01)，但高于NC组(P＜0.01)；BC组炎症评分高于MC组(P＜0.05)。 4．细菌培养结果 (1)BC组结肠细菌中乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显高于UC组(P＜0.05)且接近NC组(P＞0.05)；肠杆菌和真菌数量明显低于UC组(P＜0.05)，但肠杆菌数量高于NC组(P＜0.01)，真菌数量与NC组相比无明显差异(P＞0.05)。(2)MC组肠杆菌数量明显低于UC组(P＜0.05)，乳酸杆菌和双歧杆菌计数虽然高于UC组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；其肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌较BC组低(P＜0.05)，真菌高于BC组(P＜0.05) MC组肠杆菌与NC组比较无明显差异(P＞0.05)，真菌高于NC组(P＜0.01)，乳酸杆菌和双歧杆菌低于NC组(P＜0.01)。(3)UC组大鼠结肠中肠杆菌和真菌数量明显高于NC组(P＜0.01)，乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显低于NC组(P＜0.01)。(4)四组大鼠粪便培养未见葡萄球菌和产气荚膜杆菌。 5．内毒素水平比较 BC组内毒素水平明显低于UC组(P＜0.05)，但高于NC组和MC组(P＜0.01和P＜0.05)；MC组内毒素水平明显低于UC组(P＜0.01)，但高于NC组(P＜0.01)；UC组内毒素水平明显高于NC组(P＜0.01)。 结论 TNBS诱导的结肠炎大鼠，其结肠粘膜炎症明显，存在结肠菌群紊乱，双歧杆菌和乳酸杆菌显著减少，同时伴血浆内毒素水平明显增高。双歧三联活菌可减轻大鼠的结肠炎症，改善菌群紊乱，降低内毒素水平，但其减轻炎症的效果不如美沙拉嗪。 第二部分实验性结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中树突状细胞表型和功能的变化及双歧三联活菌的作用 目的 观察和分析结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的变化；并探讨双歧三联活菌对结肠炎大鼠肠道DCs成熟与功能的影响。 方法 实验动物、分组、模型的建立及给药见第一部分(无MC组)，动物处死时取出全部肠系膜淋巴结。免疫组化染色法检测肠系膜淋巴结DCs表面特征性标志0X-62和成熟标志CD83的表达；密度梯度离心法和淘洗法分离纯化DCs；流式细胞仪分析DCs表面分子MHC-Ⅱ及共刺激分子CD86的表达；同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果 1．大鼠肠系膜淋巴结中0X-62及CD83的表达分别为：(1)0X-62：Nc组：198.6±87.7，UC组：1422.1±598.2，BC组：805.7±298.8。(2)CD83：NC组：87.6±24.4，UC组：709.2±199.6，BC组：461.7±172.3。BC组大鼠二者的表达明显低于UC组(P＜0.05)，但高于NC组(P＜0.01)，UC组明显高于NC组(P＜0.01)。 2．大鼠肠系膜淋巴结DCs上MHC-Ⅱ和CD86的表达率分别为：(1)MHC-Ⅱ：NC组：(26.23±7.19)％，UC组：(84.55±9.38)％，BC组：(66.49±8.40)％。(2)CD86：NC组：(20.46±7.69)％，UC组：(80.63±8.84)％，BC组：(59.79±10.03)％。BC组二者的表达明显低于UC组，(P＜0.05)，但高于NC组(P＜0.01)，UC组明显高于NC组(P＜0.01)。 3．MLR试验显示BC组大鼠DCs刺激同种异体大鼠T淋巴细胞增殖的能力明显低于UC组，但强于NC组；UC组大鼠DCs刺激同种异体大鼠T淋巴细胞增殖的能力明显强于NC组大鼠。 结论 结肠炎大鼠肠系膜淋巴结中成熟的DCs明显增多，表面分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表达明显上调，刺激T淋巴细胞增殖的能力增强，提示该结肠炎大鼠存在DCs活化增多，功能增强。双歧三联活菌可明显减少其肠系膜淋巴结中成熟的DCs，使DCs表面的共刺激分子表达下调，提示该益生菌可减少肠道DCs成熟与活化，降低其刺激T淋巴细胞增殖的能力，间接减少肠系膜淋巴结T淋巴细胞的活化，从而减轻炎症。 第三部分实验性结肠炎大鼠结肠TLR2、TLR4和NF-κBp65的表达及双歧三联活菌的作用 目的 观察和分析Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)、Toll样受体4Toll-like receptor 4，TLR4)及核因子κBp65(Nuclear factor-kappap65，，NF-κBp65)蛋白及mRNA在结肠炎大鼠结肠中的表达，并观察双歧三联活菌干预后的变化，探讨双歧三联活菌对该信号通路的影响。 方法 实验动物、分组、模型的建立及给药同第一部分(无MC组)，动物处死时留取全部结肠(包括盲肠)。免疫印记法(Western Blotting)和实时荧光定量PCR分别检测大鼠结肠TLR2、TLR4、NF-κBp65蛋白及mRNA的表达。 结果 1．大鼠结肠TLR2、TLR4、NF-κBp65蛋白表达分别为：(1)NC组：TLR2：10.26±4.24，TLR4：8.16±4.50，NF-κBp65：3.16±1.52。(2)UC组：TLR2：47.20±4.62，TLR4：25.84±4.46，NF-κBp65：42.96±10.32。(3)BC组：TLR2：36.64±3.67，TLR4：19.71±3.28，NF-κBp65：30.74±7.71。分析显示三者在BC组大鼠结肠的表达明显低于UC组(P＜0.05)，但高于NC组(P＜0.01)，UC组明显高于NC组(P＜0.01)。 2．TLR4、TLR2、NF-κBp65mRNA的表达(拷贝)结果为：(1)TLR2 mRNA在NC组、UC组和BC组的表达分别为(0.24±0.14)×10~3、(10.57±2.69)×10~3和(6.64±1.42)×10~3。BC组明显低于UC组(P＜0.05)，高于NC组(P＜0.01)，UC组明显高于NC组(P＜0.01)。(2)TLR4mRNA在NC组、UC组和BC组的表达分别为(0.21±0.11)×10~3，(8.58±2.71)×10~3和(5.29±1.54)×10~3；BC组的表达明显低于UC组(P＜0.05)，高于NC组(P＜0.02)，UC组高于NC组(P＜0.02)。(3)NF-κBp65mRNA在NC组、UC组和BC组的表达分别为(0.17±0.07)×10~3、(9.69±2.71)×10~3和(6.21±1.33)×10~3。BC组的表达明显低于UC组(P＜0.05)，但高于NC组(P＜0.01)，UC组的表达明显高于NC组(P＜0.01)。 结论 TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠上模式识别受体TLR2、TLR4和转录因子NF-κBp65表达明显增高，表明与抗原接触机会增多和核转录增加；双歧三联活菌可明显降低上述模式识别受体和NF-κBp65的表达，提示该益生菌可降低肠腔抗原的摄取，减少抗原的递呈及核转录产物的生成。 第四部分实验性结肠炎大鼠粘膜与系统水平细胞因子的变化及双歧三联活菌的作用 目的 观察和分析结肠炎大鼠粘膜和系统水平细胞因子的情况及双歧三联活菌对细胞因子产生的影响。 方法 实验动物、分组、模型的建立及给药见第一部分(无MC组)。实验结束时无菌取脾及小肠派伊尔氏淋巴滤泡(Peyers’patches，PP)，分离脾细胞和PP免疫细胞，与大肠杆菌标准株共同培养72h后，酶免疫分析法(EIA)检测上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-10和TGF-β水平。 结果 1．大鼠脾细胞培养上清液细胞因子的变化 BC组TNF-α和IFN-γ水平明显低于UC组(P＜0.05和P＜0.02)，但高于NC组(P＜0.01和P＜0.03)，其IL-10水平高于UC组(P＜0.05)，低于NC组(P＜0.02)。UC组TNF—α和IFN-γ水平明显高于NC组(P＜0.01)，而IL-10明显低于NC组(P＜0.01)。IL—12水平在三组大鼠间无明显差异(P＞0.05)；各组TGF-β保持在相似的水平，虽有差异，但均无统计学意义(P＞0.05)。 2．大鼠PP细胞培养上清液细胞因子的变化 BC组TNF—α、IFN-γ和IL-12水平明显低于UC组(P＜0.05)，高于NC组(P＜0.01)，其IL-10水平高于UC组(P＜0.05)但低于NC组(P＜0.02)。UC组TNF—α、IFN-γ和IL-12水平明显高于NC组(P＜0.01)，IL-10明显低于NC组(P＜0.01)。三组大鼠的TGF-β水平相似，各组间差异小，无统计学意义(P＞0.05)。 结论 TNBS诱导的结肠炎大鼠PP细胞和脾细胞对革兰氏阴性大肠杆菌标准株的反应增强，促炎症性细胞因子TNF—α、IFN-γ和IL-12产生增加，抗炎症性细胞因子IL-10产生减少，粘膜水平和系统水平均存在促炎症性细胞因子和抗炎症性细胞因子间的平衡失调。双歧三联活菌可降低粘膜水平和系统水平的促炎症性细胞因子的产生，增加抗炎症性细胞因子的产生，减轻两类细胞因子间的失平衡。
【图文】：

较BC组低“入(0.05)，真菌高于BC组“代0.05)，UC组大鼠肠道细菌中肠杆菌和真菌数量明显高于NC组“又0.01)，乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显低于NC组(尸<0.01);四组中未培养出葡萄球菌和产气荚膜杆菌，见表2和图2表2各组大鼠粪便细菌检测结果(lgCFU/g粪便，x士s)组别n肠杆菌乳酸杆菌双岐杆菌真菌NC组 .103.98土0.416、89士 0.627.27士 0.842.15士0.51UC组 86.75士1.17a5，17士 0.85a5.14士 0.56a3.67士0.94aBe组 95

二.大鼠肠系膜淋巴结DcsOX一62和cD83的表达大鼠肠系膜淋巴结OX一62和CD83染色可见各组均有阳性染色。NC组、UC组和BC组OX一62染色的分析结果分别为198.6士87.7，1422.1士598.2，805.7士298.8，阳性面积比分别为(0.57士0.25)%，(4.1士1.7)%，(2.3士0.85)%;NC组、UC组和BC组CD83染色的分析结果分别为87.6士24.4，709.2士199.6，461.7士172.3;阳性面积t匕分别为(0.25士0.07)%，(2.0士0.57)%，(1.3士0.49)%。结果显示，BC组大鼠肠系膜淋巴结中OX一62和CD83的表达明显低于UC组(尸<0.05)，但高于NC组(尸<0.01);NC组大鼠肠系膜淋巴结中OX一62和CD83的表达较少，而UC组大鼠肠系膜淋巴结中OX一62和CD83的表达明显增多(尸<0.01)见表1、图1和彩图2一5。表1大鼠肠系膜淋巴结DCsOX一62、CD83表达的比较〔(x士S)，m，]组别nOX一62阳性面积比%CD83阳性面积比%NC组10198.6士87.70.57士0.2587.6士24.40.25士0.07UC组81422.1士598.2a4.1士l.7a709.2士199.6a2.0士0.58aBC组9805.7士298.8ab2.3士0.85“b461.7士172.3“bl.3土0.49ab注:与NC组比较:“尸<0.01;与UC组比较:bP<0.05
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574.62

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本文编号：2689438