LAMP2A在炎症性肠病中的作用和机制研究

发布时间：2020-06-02 19:50

【摘要】：背景炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一组肠道非特异性炎症疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。目前,IBD的具体发病机制尚未明确,但是普遍认为IBD发病是由多种因素相互作用共同导致,其中遗传易感者在环境的刺激下,引起的肠道内菌群失调,肠道内固有免疫和适应性免疫紊乱,从而最终引起肠黏膜损伤。在我国,IBD的发病率和患病率近年来一直呈上升态势,相关的文献报道和病例数目也逐渐增多。自噬(autophagy)是一种维持细胞正常活动的胞内吞噬现象。组织细胞通过吞噬自身细胞质蛋白,以及受损细胞器等内容物,并最终在溶酶体中分解成为氨基酸、核糖等代谢物,从而维持实现细胞的正常代谢以及稳态。目前已经研究发现的自噬方式共有三种:大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy),分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。CMA仅存在哺乳动物细胞内,具有一定的选择性,主要是通过热休克蛋白70识别含有KFERQ序列的蛋白后形成复合体定位到溶酶体,通过溶酶体相关膜蛋白2A(lysosome-associated membrane protein2A,LAMP2A)转运穿过溶酶体,最终被胞内水解。LAMP2A作为CMA的限速分子,其表达或功能异常必定会影响疾病的发生、发展。在大量关于自噬和免疫的研究中,发现自噬不仅参与了大量固有免疫而且也参与了适应性免疫应答,而IBD发病的一个重要环节就是肠道内固有免疫和适应性免疫的紊乱,因此通过调节LAMP2A的表达从而影响CMA功能,是研究IBD的一个全新突破口。此外,IBD患者肠道粘膜的病变是由肠道微生态的失衡而引起的免疫紊乱所致。肠道正常的功能依赖于肠道微生物、肠上皮细胞和肠道免疫细胞三者之间的功能协调以及动态平衡。因此,对于携带IBD易感基因的个体来说,肠道内异常微生物的定植可能是IBD发病的根源,这也为我们研究IBD的发病机制以及潜在治疗方式提供了新的思路。方法1.利用Cre/lox P系统构建了肠道上皮特异性LAMP2A过表达(specific intestinal epithelial cell-Lamp2a knock-in,LAMP2A-IECKI)小鼠。2.利用口服4%DSS溶液构建小鼠结肠炎模型,并监测造模过程中LAMP2A-IECKI小鼠及其野生型(wild-type,WT)每天体重,粪便隐血以及小鼠活动度。3.在造模第10天处死小鼠,完整取出小鼠结肠并测量长度。通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)评价造模前后小鼠肠道结构的改变,并通过免疫组化来评价肠上皮细胞LAMP2A过表达后肠道内炎症浸润情况。4.通过小鼠粪便16S rDNA高通量测序分析LAMP2A-IECKI和WT小鼠肠道微生态,从而评价经LAMP2A肠上皮细胞过表达后对肠道菌群的影响。结果1.成功建立LAMP2A-IECKI小鼠模型。2.肠上皮细胞LAMP2A过表达后增加小鼠对于DSS诱导结肠炎的敏感性:在口服DSS造模过程中,LAMP2A-IECKI组小鼠体重下降明显,粪便潜血严重,小鼠活动度降低;造模结束后,对比小鼠结肠长度发现,LAMP2A-IECKI小鼠结肠长度明显缩短,肠壁增厚变硬。3.肠上皮细胞LAMP2A过表达后可能通过增强CMA加重炎症反应:DSS造模后,LAMP2A-IECKI小鼠结肠上皮微绒毛结构排列紊乱,上皮细胞内溶酶体增多,提示CMA显著增强;炎性细胞浸润更明显,其中巨噬细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞数量明显增加,组织中IL-1释放增多,从而引起炎症级联反应,加重肠黏膜损伤。4.肠上皮细胞LAMP2A过表达后小鼠菌群结构的改变可能增加DSS诱导结肠炎的易感性:LAMP2A-IECKI小鼠菌群结构发生改变,其中Escherichia/Shigella等IBD相关致病菌的丰度增加。结论肠上皮细胞LAMPA2A过表达后可显著增强细胞CMA功能,一方面引起肠道内菌群结构的改变,致病菌定植增多,使得小鼠易感性增加。另一方面,肠上皮细胞CMA增强后,可能通过释放炎性介质,引起炎性浸润从而加重小鼠的炎症反应。
【图文】：

首先在体外构建含有目的基因 Lamp2a 的载体，在目的基因片段上游设计了两边带有 Lox P 位点的 STOP 终止子位点。之后采用胚胎干细胞技术内，将体外构建好的这段基因片段转入胚胎干细胞（embryonic stemcell，ES 细胞）内，使基因片段插入到 ROSA26 启动子范围内，，如图 1 所示。最后将 ES 细胞植入假孕小鼠子宫，最终发育成为完整胚胎。其次，利用胚胎干细胞技术通过使用不同启动子来调控 Cre 酶的表达，使得 Cre酶在特定部位产生，后 Cre 酶识别特异 Lox P 位点，催化其断裂使目的基因前的 STOP序列敲掉，以此便可以实现相应条件下某一特定基因的过表达。基于在研究 IBD 模型过程中，肠上皮细胞发挥了主要功能，所以本课题采用可以肠上皮细胞特异性Villin-Cre 小鼠。基因工程及胚胎工程技术方面的工作如目的基因片段设计及构建，ES 电转，ES细胞克隆筛选和胚胎干细胞技术等步骤均委托北京百奥赛图公司完成。相关构建策略如图 1 所示。

空军军医大学硕士学位论文MP2A 肠上皮特异性过表达小鼠的繁育过程性 ROSA26-Stopfloxed-Lamp2a（+/-）小鼠与 Villin-C行交配繁殖，如图 2 所示。F1 代小鼠周龄达到三周时，F1 代小鼠中 Lamp2a 基因和 Villin-Cre 酶基因同时表 稳 定 的 LAMP2A 小 鼠 肠 上 皮 特 异 性 过 表 达 6-Stopfloxed-Lamp2a mice, LAMP2A-IECKI 小鼠）。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

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本文编号：2693680