靶向对氧磷酶1的miRNAs的鉴定及其在非酒精性脂肪肝中的临床应用

发布时间：2020-06-04 10:46

【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一类排除了饮酒和其他明确的肝损因素,临床病理特征主要表现为肝细胞内蓄积过量脂肪的综合症。其发病机制尚不明确,主要认为与氧化应激(oxidative stress,OS)、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和遗传易感性有关,常常伴随有肥胖、糖尿病、高脂血症、心血管疾病等代谢相关疾病。对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)作为对氧磷酶家族成员之一,在脂类代谢中的抗氧化酶活性不容小觑,与多种疾病的发生发展关系密切。众多研究表明,PON1在肝脏的氧化应激反应中扮演重要角色,与健康人相比,NAFLD、肝纤维化和肝硬化患者的血清PON1活性均明显下降,但PON1的基因和蛋白表达在NAFLD中的变化研究较少,以及何种原因造成这种改变尚不明确。目的:(1)应用生物信息学方法筛选出可能靶向PON1的micro RNAs(miRNAs);(2)体外细胞实验验证miRNAs对PON1的调控作用;(3)探讨健康人和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)患者血清中PON1和miRNA的水平变化,以期为NASH患者的诊断和治疗提供新思路和新方法。方法:(1)采用Target Scan7.0软件预测可能与PON1相关的miRNAs;随后构建双荧光素酶报告基因载体,重组体转染HEK-293T细胞,报告荧光为h Rluc,校正荧光为h Luc,以h Luc荧光值与h Rluc荧光值比值表示被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性,初步确定靶向PON1的相关miRNAs。(2)在Hep G2细胞中上/下调miRNA水平,转染实验具体分组如下:正常细胞对照组、模拟物及抑制剂阴性对照组、miRNA模拟物组及其抑制剂组、荧光无关对照组。采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测各组miRNA的表达情况,并采用蛋白质印迹法(western blot,WB)检测Hep G2细胞中PON1蛋白的表达水平,以验证靶向PON1的miRNA。(3)收集34例NASH患者血清标本,并以同期体检健康者31例作为正常对照组,利用q RT-PCR技术检测前期筛选出来的miRNA在两组血清中的变化,同时采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组中PON1的蛋白表达。结果:(1)采用Target Scan7.0软件预测到了3种PON1相关的miRNAs:miR140-5p、miR183-5p和miR203a-3p。双荧光素酶活性分析显示,hsa-miR140-5p、hsa-miR183-5p和hsa-miR203a-3p模拟物对PON1野生型载体的报告荧光均具有明显的下调作用(P miR140-5p0.001,P miR183-5p0.01,P miR203a-3p0.01)。(2)体外实验的q RT-PCR结果表明,与模拟物阴性对照组相比,miR140-5p在模拟物组有更高的表达水平(P0.001),而与正常细胞对照组相比,miR140-5p表达无统计学差异(P0.05)。与抑制剂阴性对照组相比,miR140-5p在抑制剂组表达明显降低(P0.05),而与正常细胞对照组相比,miR140-5p表达无统计学差异(P0.05)。WB结果表明,与模拟物阴性对照组相比,PON1蛋白的表达在miR140-5p模拟物组明显下调(P0.001),与正常细胞对照组相比无统计学差异(P0.05);而抑制剂组则结果相反,与抑制剂阴性对照组相比,PON1蛋白的表达在miR140-5p抑制剂组明显上调(P0.01),在与正常细胞对照组相比无统计学差异(P0.05)。(3)临床NASH患者的研究显示,与健康人对照组相比,NASH患者组血清中miR140-5p的表达水平明显下调(P0.01),而其血清PON1蛋白水平明显升高(P0.05)。miR140-5p的AUCROC为0.719(95%CI:0.593~0.845),当cut-off值为0.434时,其作为NASH的筛查指标的特异性为85.3%,敏感性为58.12%。结论:miR140-5p作为PON1的上游调控因子,能够抑制PON1的表达。在NASH患者的临床研究中发现,miR140-5p的表达水平降低,而PON1蛋白表达升高,提示miR140-5p可能通过对PON1的转录后水平调控,参与NASH的进展,并有望成为NASH的诊断标志物。
【图文】：

载体,报告基因,双荧光,酶切鉴定

typeof3’-UTR(bottom) and miRNA(top)7mer-A153-59 5' ...AΜΜAΜΜΜCAACCGC||| ||||||3' ΜCACΜΜAAGAΜGGΜ7mer-m87mer-m839~451582-15885' ...CAΜAAΜGAAΜAAA|||||||3' GAΜGGΜAΜCCCA5' ...ΜΜGΜΜΜGGGΜCAA|||||||3' GAΜGGΜAΜCCCA报告基因载体酶切鉴定和载体下游引物扩增的条带理论大小为 1200bp 左。见图 1。

双荧光,安徽医科大学,硕士学位论文,组数据

安徽医科大学硕士学位论文报告荧光有明显的下调作用 (t=10.50,P<0.001) ，， hsa-miR-18iR-203a-3p 对 PON1 野生型载体的报告荧光有一定的下调83-5p=0.0014，PmiR-203a-3p=0.003),各组数据比较 P 值均小于 0.01。见图
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5

【参考文献】