对幽门螺杆菌有拮抗作用的益生菌的筛选及干预机制研究

发布时间：2020-06-06 02:12

【摘要】：目的:1.比较嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、酪酸梭菌、地衣芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌对胃粘膜上皮细胞的体外粘附能力、对胃上皮细胞的毒性作用以及对幽门螺杆菌标准株ATCC43504及临床分离多重耐药株粘附胃粘膜上皮细胞的影响。2.比较嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、酪酸梭菌、地衣芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌活菌及不同PH值发酵上清液对幽门螺杆菌的抑菌作用。3.筛选出体外具有较强抑制幽门螺杆菌粘附胃粘膜上皮细胞能力的益生菌,评价该益生菌对幽门螺杆菌脂多糖(LPS)诱导胃粘膜上皮细胞分泌IL-8的影响。4.评价该益生菌对幽门螺杆菌脂多糖诱导的胃粘膜上皮细胞TLR4、总NF-κBp65、细胞核NF-κBp65、IκBα、p-IκBα表达量的影响,初步探讨益生菌调节局部胃粘膜炎症反应的机制。研究方法:1.分离培养嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌、地衣芽孢杆菌和酪酸梭菌,采用胃正常上皮细胞GES-1细胞系作为体外细胞模型,用革兰氏染色法评估以上7种益生菌菌株的胃粘膜上皮粘附能力,用台盼蓝染色法检测益生菌对胃上皮细胞活力的影响;2.提取嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌、地衣芽孢杆菌和酪酸梭菌的发酵液,测定PH值。从萎缩性胃炎患者胃粘膜分离出多重耐药HP,对比HP ATCC43504标准菌株,用琼脂平板打孔法检测这7种益生菌活菌及不同PH值发酵液对两种HP菌株生长的影响;通过尿素-酚红试验分别观察益生菌预处理和后处理对两种HP菌株粘附GES-1细胞的抑制作用;3.提取HP ATCC43504标准株的LPS,测定LPS浓度;通过第一部分筛选出可有效粘附于GES-1细胞的益生菌,用ELISA和RT-PCR方法分别检测益生菌活菌是否可抑制HP-LPS诱导GES-1细胞产生IL-8炎症因子;4.选择可抑制HP-LPS诱导GES-1产生IL-8的益生菌,用细胞免疫组化方法检测益生菌对GES-1细胞在HP-LPS作用下细胞膜TLR_4表达量和NF-κBp65转核情况;用Western blotting方法半定量检测细胞膜TLR_4,细胞浆IκBα、p-IκBα,总NF-κB p65、细胞核内NF-κB p65表达量,初步探讨益生菌调节HP-LPS所致胃粘膜炎症的作用机制。结果:1.革兰氏染色后油镜下可见益生菌粘附于GES-1细胞,不同益生菌粘附指数有差异,益生菌对细胞粘附指数与对细胞粘附率结果一致:嗜酸乳杆菌保加利亚乳杆菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌唾液乳杆菌地衣芽孢杆菌酪酸梭菌。2.嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌、酪酸梭菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌在MOI=1:100时,4h内对细胞无明显毒性作用,4h细胞存活率平均在97%以上,组间无统计学差异。4h后益生菌开始对细胞活性产生影响,细胞存活率逐渐下降,长双歧杆菌下降最为明显,6h细胞平均存活率为92.0%,地衣芽孢杆菌下降最慢,6h细胞平均存活率为99.7%。8h后细胞存活率进一步下降,保加利亚乳杆菌组在6—8h内细胞存活率下降幅度最大,8h细胞平均存活率为82.3%。MOI=1:1000时,2h内益生菌对细胞无明显毒性作用,组间无统计学差异,2h后细胞存活率开始下降,保加利亚乳杆菌组细胞存活率下降最明显,4h为10.4%,6h时已全部死亡。地衣芽孢杆菌较其它乳酸杆菌组细胞存活率下降慢,6h仍有95.3%细胞存活,在6h后细胞存活率开始下降,8h细胞存活率为42.7%,其余乳酸杆菌组8h细胞全部死亡。3.嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、唾液乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌悬液均可以抑制HP多重耐药株和HP ATCC43504标准株的生长,地衣芽孢杆菌菌悬液对HP多重耐药株及标准株均无抑制作用。保加利亚乳杆菌组、地衣芽孢杆菌组和其它组均有统计学差异(P0.05),唾液乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、酪酸梭菌四组组间无统计学差异。嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、唾液乳杆菌、保加利亚乳杆菌上清液在PH值≤3时对HP有抑制作用,地衣芽孢杆菌的上清液对HP有生长抑制作用,且不依赖于PH值。4.GES-1细胞经过嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌预处理2h后,HP的粘附率下降,嗜酸乳杆菌组抑制作用最明显(P0.05)。益生菌对HP粘附GES-1细胞的抑制能力:嗜酸乳杆菌保加利亚乳杆菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌唾液乳杆菌。由于酪酸梭菌和地衣芽孢杆菌菌体本身不能粘附于GES-1细胞,因此不能减少HP的粘附率。益生菌后处理组,HP胃细胞粘附率未见下降。5.在HP-LPS的刺激下,GES-1细胞分泌的IL-8量明显增高,是空白对照组的近10倍,预先与保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌作用2h后,GES-1细胞IL-8的分泌量较HP-LPS减少,保加利亚乳杆菌组作用最明显,IL-8分泌量减少了50%左右(P0.05)。嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌预作用组IL-8分泌量较HP-LPS组略升高,无降低IL-8的作用。6.正常生理情况下,GES-1细胞核内很少表达NF-κB p65,胞膜上有少量TLR4表达,胞浆内有大量IκBα表达,当受到HP-LPS刺激60min后,胞浆内NF-κB p65开始转移至细胞核内,TLR_4和p-IκBα表达增多,IκBα降解(P0.05),3.0*10~(^7)cfu/ml保加利亚乳杆菌预作用细胞2h后,NF-κB p65转核量减少(P0.05),TLR_4表达量减少(P0.05),p-IκBα表达减少,IκBα降解量减少(P0.05)。结论:1.嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌对胃粘膜上皮细胞有较好的粘附性;在一定浓度内(MOI=100)4h对胃上皮细胞活力没有影响。2.嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、酪酸梭菌、唾液芽孢杆菌的活菌和发酵液在PH值≤3时对HP多重耐药株和HP标准株均有一定的生长抑制作用,抑菌物质考虑为有机酸,地衣芽孢杆菌活菌没有抑制作用,发酵液有明显的抑制作用且与PH值无关。3.嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、唾液乳杆菌可预先占据胃上皮细胞粘附位点,减少HP的粘附,但HP粘附于细胞后,益生菌不能将HP排挤出。4.保加利亚乳杆菌可以通过TLR4-NF-κB途经减少HP-LPS诱发的GES-1细胞IL-8的生成。
【图文】：

菌落形态,嗜酸乳杆菌,菌落形态,乳杆菌

中国医科大学博士学位论文3.1.7 唾液乳杆菌唾液乳杆菌厌氧生长，平板生长形态（图 3.1.13）：菌落圆形凸起，乳白色，光滑，有光泽，直径 1—2mm，挑起托丝粘稠。革兰氏染色（图 3.1.14）革兰氏阳性，呈短杆状，二端呈圆形，通常单独出现，成对短链状，，无荚膜无芽孢，无鞭毛，不运动。

嗜酸乳杆菌,细胞形态,乳杆菌,唾液

中国医科大学博士学位论文3.1.7 唾液乳杆菌唾液乳杆菌厌氧生长，平板生长形态（图 3.1.13）：菌落圆形凸起，乳白色，光滑，有光泽，直径 1—2mm，挑起托丝粘稠。革兰氏染色（图 3.1.14）革兰氏阳性，呈短杆状，二端呈圆形，通常单独出现，成对短链状，无荚膜无芽孢，无鞭毛，不运动。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R573

【参考文献】