转染绿色荧光蛋白的大鼠胚胎肝干细胞的鉴定及治疗急性肝损伤的研究

发布时间：2020-06-07 06:29

【摘要】： 终末期肝病包括晚期肝癌以及很多肝脏代谢性疾病目前尚无理想治疗方法,肝移植被认为是最有效的治疗手段,但同时也存在很多问题,比如肝源不足、手术创伤大、排斥反应等。随着肝干细胞研究的不断深入,近年来国内外报道了很多肝干细胞的分离的成功经验,发现了大量肝干细胞表面标志,并采用了多种实验技术对肝干细胞进行标记和示踪,以便能对其分化和体内移植后的迁移分化进行示踪研究,其中利用荧光蛋白基因修饰肝干细胞的技术已经比较成熟并得到公认。利用肝干细胞作为种子细胞移植到受体体内治疗相关肝脏疾病的研究也越来越多。与肝移植比较,肝干细胞移植具有操作简单、创伤小、可重复进行、一肝多用等优点,因此肝干细胞和肝干细胞移植的研究越来越成为热点并取得了一定的研究进展。本实验室从孕14d大鼠胚肝中分离出大鼠肝干细胞,并用pAcGFP1-N1转染干细胞使其能表达GFP作为示踪。在转染pAcGFP1-N1的基础上,本实验进一步研究转染荧光蛋白基因对肝干细胞在体外培养时功能的影响。并建立动物急性肝损伤模型,初步探索干细胞移植对大鼠急性肝损伤的修复作用。一转染绿色荧光蛋白的大鼠胚胎肝干细胞的鉴定本实验采用脂质体法转染pAcGFP1-N1质粒到大鼠胚胎肝干细胞。荧光倒置显微镜证实转染成功后,分别按培养时间和消化时间不同挑选肝干细胞,挑选的细胞再次培养至铺满瓶底后收集细胞培养上清液,应用ELISA方法测定ICAM-1含量。实验按照接种时间不同和胰酶消化时间不同分组,用流式细胞仪检测c-Met阳性细胞的比例。镜下见胚胎干细胞在转染pAcGFP1-N1质粒后细胞形态较转染前无明显变化,荧光倒置显微镜见大量细胞发出绿色荧光。各组细胞ICAM-1含量和c-Met阳性细胞都随培养时间延长而减少,随消化时间延长而增多。实验证明胚胎肝干细胞在转染荧光蛋白质粒pAcGFP1-N1后镜下细胞形态无变化,转染后的细胞培养时先贴壁的细胞和消化时后被消化下来的细胞表达更多的细胞粘附分子ICAM-1,并表达更多的肝干细胞表面标志c-Met,这种方法有利于分选出纯度更高的肝干细胞。二大鼠胚胎肝干细胞移植对大鼠急性肝损伤的修复作用本实验用60%四氯化碳色拉油溶液建立大鼠急性肝损伤模型,实验分为对照组,移植组和正常组。建模成功后移植组大鼠股静脉注射转染荧光蛋白基因的干细胞。对照组和正常组股静脉注射生理盐水。分别于建模开始第1、14、18、30天断尾取血检测血清ALT、AST、TBIL。取肝组织观察移植后肝脏内荧光蛋白的表达并做石蜡切片并行HE染色光镜下观察。观察到肝干细胞移植后移植组的各组测量值明显较对照组降低,HE染色见移植组肝结构基本恢复和肝细胞再生,对照组结构较紊乱,肝细胞再生不明显,移植组可见散在绿色荧光分布。说明胚胎肝干细胞经股静脉移植对急性肝损伤有明显治疗作用,证实了肝干细胞的归巢现象。
【图文】：

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图 1 转染 pAcGFP1-N1 后的大鼠胚胎干细胞（×400）Fig.1 Rat embryonic hepatic stem cells aftertransfection of green fluorescent protein gene（×400）图2 转染pAcGFP1-N1后的大鼠胚胎干细胞的荧光观察（×400）Fig.2 Green fluorescent of the stem cells aftertransfection（×400 ）

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transfection of green fluorescent protein gene（×400）图2 转染pAcGFP1-N1后的大鼠胚胎干细胞的荧光观察（×400）Fig.2 Green fluorescent of the stem cells aftertransfection（×400 ）图 10 正常大鼠肝脏 HE 染色，可见肝细胞索排列规则，，细胞核圆居中，核膜清晰，肝细胞核染色浅，核仁清楚（×400）Fig.10 Normal rat liver（×400）图 11 对照组肝脏 HE 染色，第 14 天可见大片坏死，结构紊乱，大量肝细胞空泡状变性，有严重出血（×400）Fig.11 Control team rat liver 14th day（×400）（×400?
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575;R735.7

【参考文献】