乙型肝炎患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）表位变异的测序分析

发布时间：2020-06-09 10:20

【摘要】： 乙型肝炎是危害人民健康的重要疾病。虽然在其发病机制取得了多方面的进展,但仍有许多重要问题需要阐明。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)本身通常并不直接导致肝细胞损害,而大量淋巴细胞浸润肝脏提示细胞免疫与乙型肝炎肝细胞的损伤密切相关。HBV抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)应答是机体清除或控制肝细胞内HBV感染的主要机制。病毒蛋白中的CTL表位(epitope)是特异性CTL识别和攻击的目标。由于CTL表位的递呈受到宿主HLA-I类分子的限制,同时HBV基因型对CTL的变异影响明显,因而研究患者的CTL表位变异时需要确定患者的HLA-I分型和感染的HBV基因型。本研究应用PCR产物直接测序法,通过对HBV基因组全序列的测定,分析了急性乙型肝炎(acute hepatitis B, AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和慢性重型乙型肝炎(chronic severe hepatitis B, CSHB)患者的HBV特异性HLA-A2限制性CTL表位变异情况,同时根据序列确定HBV基因型并分析了其对CTL表位变异的影响,旨在找到可能与乙型肝炎病程发生发展相关的表位变异。结果总结如下: 1.运用“重叠两段法”巢式PCR扩增HBV基因组全序列。获得516例乙型肝炎患者HBV全序列,其中AHB患者131例(已提交GenBank);CHB患者239例(GenBank号: FJ386574-FJ386689 , FJ562218-FJ562340 ); CSHB146例( GenBank号:EU939536-EU939681)。 2.运用MEGA 4.0软件分析HBV全序列构建进化树进行HBV基因分型。其中急性乙型肝炎患者中,B基因型27例占20.6%;C基因型103例占78.6%;D基因型1例占0.8%;慢性乙型肝炎患者中,B基因型51例占21.3%;C基因型184例占77.0%;D型4例占1.7%;慢性重型乙型肝炎中,B基因型33例占22.6%;C基因型111例占76.0%;D基因型2例占1.4%。三组患者的病毒基因型构成比无显著差异。 3.通过血清学和细胞学方法对516例乙型肝炎患者进行HLA-A2基因分型。结果AHB患者中HLA-A2阳性67例,占51.1%;CHB患者中HLA-A2阳性109例,占45.6%;CSHB炎患者中HLA-A2阳性71例,占48.6%。三者之间统计学上没有差异,与文献报道的健康人群阳性比例也没有明显差异。 4.根据文献报道已经鉴定过的HBV特异性HLA-A2限制性CTL表位来分析获得的HLA-A2阳性患者的表位变异结果。所有HBV基因型患者一起进行比较时,X92-100和S177-185表位变异发生率在AHB、CHB和CSHB三组患者有极显著差异(P均0.01)。.仅HBV B基因型患者进行比较时,P455-463和P816-824表位变异发生率在三组患者间有极显著差异(P均0.01)。仅HBV C基因型患者进行比较时,三组患者间有6个表位变异发生率有显著或非常显著差异,包括X92-100(P0.01)、X102-110 (P0.05)、X115-123 (P0.05)、S131-139 (P0.05)、S177-185 (P0.01)和S183-191 (P0.05)。此外,S335-343 (P=0.05)和S269-278 (P=0.11)表位变异发生率也有明显差别,虽然P值未达到显著差异,但经SAS软件趋势检验,三组患者在该表位有相关趋势,增大样本量可达到显著差异。多数变异表位中只有一个氨基酸发生了替换,少数表位可有多个氨基酸发生改变,例如X36-44、S201-210和S204-212表位。由于一些表位相互重叠,包括S177-185和S183-191、S201-210和S204-212、S269-278和S271-280、S335-343和S338-347表位间,从而一个位点的氨基酸变化可以引起两个CTL表位同时变异。表位C18-27(FLPSDFFPSV)247例患者中有227例(占91.9%)突变为FLPSDFFPSI,而表位X52-60(HLSLRGLFV)和表位S370-379(SIVSPFIPLL)突变率都为100%,分别突变为HLSLRGLPV和NIVSPFIPLL。根据以上结果分析,某些HBV特异性HLA-A2限制性CTL表位变异发生率与疾病严重程度相关,提示CTL表位变异可能是影响乙型肝炎慢性化和重症化进程的一个病毒学因素。
【图文】：

序列,基因组结构,电镜,形态

liver failure, ACLF)，死亡率较高。上述复杂疾病谱的发病机制尚不清楚，一致认为其发病机制中免疫反应密切相关，受 HLA-I 类分子严格限制的特异性别感染肝细胞是造成肝损伤的主要原因。因此，研究病毒感染诱发的特异性免疫明感染的发病机制具有重要意义。1.1 乙型肝炎病毒（HBV）概述1.1.1 HBV 基因组特点HBV 是一种有包膜的双链 DNA 病毒，属于嗜肝病毒科。HBV 的基因组是部链的 DNA 分子，长度约为 3200bp(如图 1)。两条线性 DNA 链通过 5’端间的 22性末端构成环状结构，粘性末端的两侧各有一个 11bp 组成的直接重复序列，被DR1 和 DR2。在 HBV 颗粒内，HBV 负链的长度是固定，有明确的 5’和 3’端，但负链并不是闭环结构，在正链的 5’ 末端附近，负链上有一缺口，并且，负链的有 8～9bp 的冗余，使这一小段成为 3 链结构。HBV 多聚酶(polymerase, pol)与负5`端通过共价键结合。正链的 5`端附着一个 18bp 长的寡核糖核苷酸，具有RNA(mRNA)一样的帽状结构。正链的 3`末端长度不固定，因此大多数 HBV 基因含有一段单链的、长度不一的缺口区域(gap region)，这段区域可借助内源性的DNA 多聚酶补齐而成为双链[5]。

作用靶,限制性,细胞

在 B、C 型高度流行的亚洲国家,家族垂直传播和怀孕围产期感染为 HBV要感染传播方式。相反,A、D、E、F 和 G 基因型则主要存在于以水平传播为主的感染式的地域。HBV 基因型与感染传播方式是否相关仍需进一步研究证实。.1.4 HBV 感染与宿主免疫间的关系在 HBV 的感染过程中，CTL 细胞对于病毒的清除起着重要作用。CTL 细胞识别在大数宿主肝细胞表面表达的 MHC－I 类分子和多肽片段形成的复合物。因此，，它能够直识别被病毒感染的细胞，并在感染部位发挥主要效应（如图 2）。被感染细胞内的病蛋白在细胞质内经酶的作用被降解，这些降解产物借助于 TAP 转运到内质网[15]。在质网中转运的多肽与 MHC－I 类分子的重链结合，形成稳定的 I 类分子-β2 微球蛋复合体，经高尔基体转运至细胞表面。CTL 细胞识别细胞表面的这些 I 类分子－肽合物后，通过两种途径发挥抗病毒作用。一是释放细胞杀伤因子（IFN-γ 和 TNF-），另一是直接释放溶细胞颗粒（内含穿孔素和丝氨酸酯酶）穿孔素可在靶细胞膜上孔，丝氨酸酯酶由此进入靶细胞核内，导致程序性细胞死亡[16-17]。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62

【参考文献】