Erbin通过抑制自噬性细胞死亡延缓炎症性肠病进程的研究

发布时间：2020-06-09 12:09

【摘要】：随着消化内镜技术的广泛应用,我国炎症性肠病(Inflammantory bowel disease,IBD)的检测率逐年增加,并且IBD患者如不进行及早干预其患结直肠癌的风险增加,但是目前对炎症性肠病发病机制尚缺乏足够的了解。Erbin(也称Erbb2ip),最早于1997年作为Erbb2的相互作用蛋白被发现。它属于LAP(leucine rich repeat and PDZ domain)蛋白家族的一员。已有的研究表明,Erbin在调节细胞增殖分化、心脏发育、髓鞘形成以及在肿瘤的发生和转移中的发挥着重要作用。Erbin在IBD的作用如何尚不明确。本文主要探讨Erbin在炎症性肠病中发挥的作用及其相关机制。前期我们发现,Erbin基因在人炎症性肠病临床标本、急性溃疡性结肠炎小鼠肠组织及自发性慢性炎症性肠病小鼠(IL-10-/-)肠组织中表达均较对照正常结直肠组织明显降低。同时我们观察到,Erbin△c/△c(Erbin PDZ功能域缺失)的小鼠易感炎症性肠病。本研究中,我们应用crispr/cas9技术构建Erbin完全缺失的小鼠模型(Erbin~(-/-)),该小鼠Erbin第16位外显子一个碱基的缺失,造成移码突变,蛋白提前终止。利用Erbin~(-/-)小鼠模型,我们进一步明确了Erbin在IBD中的作用并对其机制进行了探讨。首先,我们使用DSS诱导类似临床溃疡性结肠炎特征的小鼠肠炎模型。通过监测Erbin~(-/-)及Erbin+/+小鼠的体重,比较其肠重与体重比值,及评估肠上皮炎症范围,隐窝损伤等,进一步确定Erbin~(-/-)小鼠较Erbin+/+小鼠更易感肠炎随后,我们分别在体内和体外研究Erbin如何抑制炎症性肠病的发生。基于C57小鼠构建的溃疡性结肠炎模型和IL-10-/-小鼠模型,我们发现,两种模型小鼠其结直肠Erbin表达下调、自噬标志物LC3B表达增强。进一步我们发现,与对照组小鼠肠上皮相比较,Erbin~(-/-)小鼠肠上皮其LC3B的表达增强、自噬相关蛋白ATG16L1和ATG2A表达减弱。通过透射电镜我们检测到,自噬溶酶体数目在Erbin~(-/-)小鼠的结直肠上皮中较对照组小鼠结肠上皮明显增多;与野生型小鼠相比,DSS诱导后Erbin~(-/-)小鼠结直肠上皮中自噬溶酶体数目明显增多,并伴有广泛的线粒体肿胀。体外实验中,我们应用TNF-α刺激293T细胞模拟体内炎症因子对细胞的损伤。细胞免疫荧光检测发现,TNF-α刺激后细胞自噬小体增多。若用TNF-α刺激低表达Erbin的细胞,其自噬小体数目较单纯给予TNF-α刺激明显增多。RT-PCR检测证实,自噬小体数目增多伴有LC3B在转录水平表达增加。同时,我们用流式细胞技术检测到TNF-α刺激CT26细胞22小时,细胞死亡率为40%;在敲低Erbin的情况下使用TNF-α刺激该细胞22小时,细胞死亡率达到了90%,提示敲低Erbin会促进TNF-α诱导的细胞死亡。最后,我们用体内模型进一步验证Erbin是否通过抑制自噬通路抑制炎症性肠病。我们在DSS诱导Erbin~(-/-)小鼠炎症性肠病模型的同时,用自噬的抑制剂氯喹作用于该小鼠,HE染色发现与未使用氯喹的Erbin~(-/-)小鼠相比,自噬抑制剂氯喹的使用能显著减缓改善DSS诱导的Erbin~(-/-)小鼠结直肠粘膜的炎症细胞浸润和隐窝上皮细胞损伤。与此同时,我们检测到使用氯喹后DSS诱导的Erbin~(-/-)小鼠结直肠上皮中凋亡相关蛋白表达量较未使用氯喹的DSS诱导Erbin~(-/-)小鼠下降。综上所述,我们的研究明确了Erbin在炎症性肠病中的重要作用,并初步发现Erbin基因可通过抑制细胞自噬性死亡抑制炎症性肠病的发生发展,这为临床炎症性肠病的治疗提供了新的线索。
【图文】：

制作原理,小鼠

rbin 通过抑制自噬性细胞死亡延缓炎症性肠病进程的研究第二第二章材料与方法1.材料1.1 小鼠Erbin-/-小鼠：SPF级别实验中心繁育，Erbin完全缺失小鼠。基于C57背景鼠用CRISPR/cas9技术构建，A图中所示Erbin第16位外显子中A碱基的缺失，，造码突变，蛋白提前终止。B中WB检测繁育的Erbin-/-小鼠结直肠几乎不表达该。同时RT-PCR检测繁育的Erbin-/-小鼠结直肠几乎不表达该蛋白，*P < 0t-test)。

小鼠,月龄,组织病理学,隐窝

19图 1-1 Erbin 缺失后小鼠肠道炎症反应和上皮损伤情况（A）3.5 月龄和 9 月龄Erbin-/-小鼠和 Erbin+/+小鼠大体和镜下 HE 结直肠变化（B）在 3.5 个月大和 9 个月大的 Erbin-/-和 Erbin+/+小鼠中，炎症的组织病理学评分，炎症范围深度和隐窝损伤。数据表示为每组小鼠的百分比与指示的分数Figure1-2 Figure 3: Intestinal inflammatory response and epithelial injury inexperimental IBD mouse model after Erbin was deleted. (A) Gross appearance andrepresentative H&E staining of colorectum in 3.5-month-old and 9- month-oldErbin-/-mice and Erbin+/+mice. (B) Histopathological scorings of the inflammation,depth of inflammation, and crypt damage of colorectum in 3.5-month- old and9-month-old Erbin-/-mice and Erbin+/+mice. Data are represented as the percentage ofmice per group with the indicated score.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

【参考文献】