丙酮酸脱氢酶激酶4介导FXR调节肝脂质代谢的机制研究

发布时间：2020-06-09 12:51

【摘要】：【目的】法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)又称作胆汁酸受体,在糖脂代谢中起着重要作用,FXR敲除可以导致小鼠肝脂肪变性,但机制并不十分清楚。本研究拟探讨FXR作为胆汁酸核受体转录因子调控肝脂质代谢的分子机制。【方法】1)利用高脂饲料和普通饲料分别喂养FXR敲除(FXR~(-/-))小鼠和C57BL/6J野生型小鼠,构建非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型,第71天和80天分别测定小鼠葡萄糖耐量实验和胰岛素敏感性,90天后处死,分别采用Western blot、q RT-PCR和免疫组化检测小鼠肝脏丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK4)表达情况;HE和油红O染色观察小鼠肝脏形态学变化及脂滴情况;全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂和肝酶类水平。2)动物水平通过腹腔注射DCA(PDKs的抑制剂)同时加高脂饮食喂养FXR~(-/-)小鼠,第4周测定小鼠葡萄糖耐量实验,第5周处死动物,取相同部位肝脏组织进行HE和油红O染色,观察小鼠肝脏形态学变化及脂滴聚集情况;全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂和肝酶类水平,Western blot检测肝脏脂质代谢关键酶类表达情况。3)利用CRISPR/Cas9技术构建FXR基因敲除肝LO-2细胞系,Western blot检测FXR缺失的LO-2细胞系中PDK4表达水平,用油酸钠/棕榈酸钠诱导细胞构建高脂环境,通过BODIPY试剂检测细胞脂滴聚集情况。【结果】1)与WT小鼠体重比较,普通饮食情况,FXR~(-/-)小鼠体重比无差异,高脂饮食,FXR~(-/-)小鼠体重(39.46±3.23g)与WT小鼠体重(50.72±2.16g)相比明显减轻,体重增长缓慢甚至下降。FXR~(-/-)小鼠肝脏增大(普通饮食喂养时是WT的1.24倍,高脂饮食则是WT的2倍),肝脏表面偏韧,出现凹凸不平的褶状,色泽偏淡,切面略带油腻感,高脂诱导会加重其病理状态。HE和油红O染色发现FXR~(-/-)小鼠肝脏出现空泡化,脂滴聚集,高脂诱导会使肝脏空泡增大,脂滴聚集加重。FXR缺失还会引起小鼠血清中TG、NAFA、LDL水平显著升高,HDL降低,ALT、AST、ALP升高,提示FXR基因缺失导致小鼠血脂升高,肝脏脂代谢紊乱,最终引起肝损伤。RNA-seq检测普通饮食喂养时FXR~(-/-)小鼠肝脏各基因表达水平,与WT小鼠肝脏比较发现FXR~(-/-)小鼠肝脏的PDK4表达升高差异有统计学意义,Western blot、免疫组化和q RT-PCR进一步验证了此结果,而高脂饮食下,FXR~(-/-)小鼠肝脏中的PDK4表达升高差异没有统计学意义。2)腹腔注射DCA后能改善FXR~(-/-)小鼠饮食和体重情况、降低肝脏/体重和腹部脂肪/体重比,改善葡萄糖水平,降低血清中LDL水平,减少肝脏脂滴聚集。Western blot检测小鼠肝脏组织中脂质和甘油三酯合成关键蛋白酶,发现DCA能促进FASN和ACC的表达,降低ACLY的表达;同时降低脂质代谢相关蛋白酶如HSL、PPARα和PPARγ的表达;FXR缺失会导致m TOR水平增加,而DCA可能通过抑制m TOR表达来调控肝脂质代谢。3)FXR敲除的LO-2细胞系中PDK4的表达增加,且高脂培养基环境诱导下FXR敲除细胞会加重脂滴聚集,而干扰PDK4后,脂滴聚集减少。【结论】FXR缺失会引起肝细胞脂代谢紊乱,肝脏脂滴聚集,血清中血脂升高,具体机制与肝细胞中PDK4表达上调有关,抑制PDK4的表达后能够改善肝细胞脂滴聚集,缓解FXR缺失导致的肝脂质代谢紊乱。
【图文】：

高脂饮食,葡萄糖代谢,体重变化,表观

24图 4-1 普通和高脂饮食下 FXR-/-小鼠肝脏解剖表观、饮食、体重变化和葡萄糖代谢情况随机将 FXR-/-和 C57BL/6J 野生型小鼠分成普通饮食（STD）和高脂饮食（HFD）喂养组，记录体重和饮食情况，71 天后测定葡萄糖耐量，80 天后测定胰岛素敏感实验，90 天后处死。（A）小鼠解剖肝脏表观图。（B）肝脏体重比。（C 和 D）分别为体重和体重增长率。

变化情况图,高脂饮食,血脂,小鼠血清

图 4-2 FXR-/-小鼠血清中血脂和肝酶指标在普通和高脂饮食下的变化情况随机将 FXR-/-和 C57BL/6J 野生型小鼠分组成普通饮食（STD）和高脂饮食（HFD）喂养组，喂养 90 天后处死，测血清各生化指标。（A）游离脂肪酸（NEFA）。（B）总胆固醇（TC）。（C）甘油三酯（TG）。（D）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。（E）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。（F）谷丙转氨酶（ALT）。（G）谷草转氨酶（AST）。（H）碱性磷酸酶（ALP）。（I）AST/ALT 比值。n=5，*P<0.05，**P<0.01，***<0.001。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5

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