幽门螺杆菌cagA基因的克

发布时间：2020-06-10 05:54

【摘要】： 第一章幽门螺杆菌cag A基因的克隆、原核表达及免疫活性研究 目的:克隆胃癌特异性幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的cagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的免疫原性。为临床胃癌相关H.pylori菌株筛选和针对性治疗奠定基础。 方法:选取前期研究确定的可能与胃癌相关的第6型菌株cagA基因片段,在GenBank中确定为AAG09884,优化设计并合成cagA基因。并在该基因两端分别添加内切酶位点,将合成的cagA基因从puc57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨卞青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-cagA。以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western-blot鉴定融合蛋白的抗原性。 结果:1.靶基因合成:设计并人工合成了cagA基因片段(AAG09884),该基因长度为678bp,编码228个氨基酸(图1-1)。序列测定结果显示,合成的cagA基因序列与设计的序列完全一致。2.成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,其目的cagA基因的测序结果与设计的序列同源性为100%,对应蛋白序列同源性100%。3.含pET32a-cagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达出CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白分子量大小与预期相一致(45KD)。4.Western-blot检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。 结论:1.成功合成H.pylori菌株cagA基因片段,经测序分析其氨基酸序列与GenBank上AAG09884的同源性达100%。2.成功构建原核表达质粒pET32a-cagA,经IPGT诱导转化宿主菌,获得分子量约45KD的CagA融合蛋白,且此蛋白具有CagA蛋白的抗原性。 第二章幽门螺杆菌cagA基因在胃上皮细胞中的表达及其对细胞凋亡的影响 目的:构建含cagA基因的真核表达载体,并在胃上皮细胞GES-1中表达,观察其表达和定位情况及其对细胞凋亡的影响。 方法:将合成的cagA基因片段从puc57-cagA质粒中切出,分别克隆至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1及表达载体pCDNA3.1-his/myc-A,用脂质体法分别将重组表达载体转染入胃上皮细胞GES-1中,用荧光显微镜观察其在GES-1细胞中的表达及定位,用荧光实时定量PCR及Western-blot检测cagA基因在细胞中的表达情况。用流式细胞仪观察CagA蛋白对细胞凋亡的影响。 结果:1.成功构建pEGFP-C1-cagA和pCDNA3-1-his/myc-A-cagA真核表达质粒,目的基因的测序结果与设计的序列完全一致。2.绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-cagA转染GES-1后,其表达分布于细胞质和细胞核中。3.表达质粒pCDNA3.1-his/myc-A-cagA转染GES-1细胞后,cagA基因在细胞中获得了表达。4.转染pCDNA3.1-his/myc-A-cagA的GES-1细胞行流式细胞仪分析示CagA蛋白有促进细胞凋亡的作用。 结论:1.成功构建幽门螺杆菌cagA基因的真核表达质粒,并在胃上皮细胞株GES-1中获得了表达,且在细胞质和细胞核内均有表达。2.经流式细胞仪分析,CagA蛋白具有促进胃上皮细胞株GES-1凋亡的作用。
【图文】：

1.2.3.3.1酶切:取两个500pIEP管，一个加入pET一32a载体，一个cagA基因的重组质粒，然后分别加入水、酶助月I，酶Xholl及其buf量如下:Plasmid6p1PET一32a2pl助刀1lplKPnllpl盘为0111pIJ扮0111pl10XHBuffer2pl10XBufferH2plddH2010p1ddHZO14pl总计20p1.总计20pl37℃水浴酶切过夜。1.2.3.3.2琼脂糖凝胶电泳，回收:将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检出现带有。agA基因片段的带(约700bp)和线状pET一32a载体的带(5.7

(2)封闭:转印膜用PBS洗涤3次，每次约10min。将膜置于封闭液中，4℃过夜。靶蛋白与一抗的反应:次日将膜用PBS洗涤3次，每次1腼in。再置于用PBS稀释的一抗(1:500)中，室温微摇2h。靶蛋白与二抗的反应:取出膜用PBS洗涤3次，每次1枷in。再将膜置于用PBS稀释的二抗(l:1000)中，室温微摇lh后，用PBS洗涤3次，每次10min。(3)显色:将膜置于NBT/BCIP显色液中显色，，待显色充分时立即用去离子水洗涤并照相。3结果3.Ica护基因的优化设计与合成结果设计并人工合成了cagA基因(从G09884)，该基因全长为678bp，编码228个氨基酸(图l一2).序列测定结果显示，合成的ca妞基因序列与设计的序列完全一致。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R573

【参考文献】

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本文编号：2705872